利用PCR分析酵母菌落

用 PCR 分析酵母菌落時，無需純化 DNA。本方案以單個酵母菌落的粗裂解液作為 PCR 擴增的模板，來確定酵母中是否攜帶目的 DNA 序列。 

Taq DNA 聚合酶 寡核苷酸引物 DNA 標準參照物 YAC 重組子的酵母菌株

PCR 緩沖液 dNTP 溶液

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 微量離心管 程控式 PCR 儀

一、材料

1. 緩沖液和溶液

10X 菌落 PCR 緩沖液

dNTP 溶液（10 mmol/L), 含有 4 種 dNTP ( pH 8.0，PCR 級）

MgCl₂ ( 25 mmol/L)

2. 酶及其緩沖液

Taq DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

DNA 標準參照物

5. 專用設備

微量離心管（0.5 ml)

儲存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 儀

6. 載體和酵母菌株

攜帶有目的 YAC 重組子的酵母菌株

二、方法

1. 在一個無菌的 0.5 ml 微量離心管里，依次序加入下列物質：10X 菌落 PCR 緩沖液 2 ul，25 mmol/L MgCl₂ 1.2 ul，10 mmol/L dNTPs 0.4 ul，寡核苷酸引物 每個引物濃度為 10 pmol，Taq 聚合酶 5 單位（0.2 ul），H₂O 加至總體系為 20 ul。

2. 用一個黃色的一次性移液器吸頭，吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 ul )，加入反應體系。

3. 將 PCR 管放進 PCR 儀內。按下面程序進行 PCR 反應。



4. 用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 PCR 產物。電泳應采用適宜大小的標準參照物。

1.  設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。

2.  使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的循環數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環降0.2度左右。