五.膜的深入探討和應用技巧
從本節開始,我們開始對膜進行深入討論和談一些應用技巧.
1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理, 已知的結合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等,確切的結合原理并不明確,主要靠假說來支撐.主要有兩種假說:
1) 首先兩者靠靜電作用力結合, 然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合.
2) 首先兩者靠疏水作用結合, 然后靠靜電作用來維持長時間結合.
兩條假說, 都表明其結合過程分為兩步, 首先結合和后面長時間結合.由于結合原理的不明確性, 導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗.
2. 膜對結合的影響
1)膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜,但是請注意這只僅僅限于同一廠家的產品,如果是不同廠家的產品,這種比較是無意義的. 膜孔徑與層析速度的關系,已在上文描述.
隨著膜孔徑減小,膜的實際可用表面積遞增,膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數為表面積比率(實際可用表面積與所用膜平面積的比率).
另外, 膜孔徑越小,層析速度也越小,那么金標復合物通過T線的時間也就越長,反應也就越充分.
綜合以上兩點,結論為膜孔徑越小靈敏度越高.但是同時也減慢了跑板速度,增加了非特異性結合的機會,也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜,找到合適的平衡點.
2)不同廠家的膜差異
這個差異主要來源于兩點:
1> 生產膜時,使用的聚合物和表面活性劑的來源,類型,數量不同.同理,在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響.
2> 處理過程不同.
3. 生物原料,緩沖溶液的試劑和配方
1) 生物原料, 作為CT線的生物原料使用情況各異,所以這里只做略述.
首先,單克隆抗體與膜的結合優于多克隆抗體, 主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點, 而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別, 毫無疑問就增加了優化難度.
其次,分子量越大,蛋白越難結合到固相材料上.
2)緩沖液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方,包括緩沖液,封閉液等等處理溶液配方.
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單. 因為不同的反應體系需要不同的配方來支持, 而不同機構的反應體系又有差異. 想獲”魚”先學”漁”. 為了不誤導大家,我在下面涉及到配方的問題上,僅提供思路,具體配方請自己摸索.
緩沖液的構成一般是: PBS(或其他緩沖體系)+作用物質(針對某一特定問題)+PH調整. 我在參考過以前的各種資料后,個人意見為配方原則為宜簡不宜繁,根據自己的需要添加作用物質,原來的很多需要添加的作用物質,由于膜制造技術的改進已經不再需要.
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2, 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性.
作用物質的情況大致羅列如下:
少量NACL,減少信號強度,消假陽.
有機醇(甲醇,異丙醇等),潤濕膜,減少膜帶有的靜電,利于結合包被.個人不推薦,因制膜工藝改進.
表面活性劑(TW20,TX100),增加親水力,可避免線條中空現象,也可增色.
糖,保護劑,減緩老化速度,也可以增加親水力同上.
調PH到某個位置,可以消假陽.
4. 點樣環境
環境濕度對點膜過程非常重要.最佳濕度一般在45-65%.
濕度過低,膜上容易聚集靜電荷,點膜容易出現散點,導致測試會出現疏水斑.
濕度過高,膜上毛細作用加強,點膜容易引起CT線變寬甚至擴散.