制備克隆用PCR產物的純化

蛋白酶 K

乙酸銨 氯仿 乙醇 酚 氯仿 TE

瓊脂糖凝膠 DNA 純化樹脂 水浴

一、材料

1. 緩沖液與溶液

乙酸銨（10 mol/L)

氯仿

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V）

TE ( pH 8.0)

2. 酶與緩沖液

蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

3. 凝膠

含 0.5 μg/ml 溴化乙錠的瓊脂糖凝膠

4. 核苷酸與寡聚核苷酸

經 PCR 擴增的 DNA 產物的純化

5. 特殊設備

DNA 純化樹脂

水浴預先設置在 75℃

二、方法

1. 集中 8 支 PCR 反應管的反應液（約 400 μl），內含有目的基因擴增片段 1 μg。

若非特異性擴增產物明顯地存在著（如從凝膠電泳上見到非特異性條帶等)，可通過低融點凝膠電泳從電泳膠上回收純化目的產物。

如果盛有 PCR 反應混合液的離心管上覆蓋有一層礦物油，用于防止樣品在反復熱-冷循環中蒸發，收集反應混合液樣品時應該先行離心，然后吸取下層水相液體于一個新的離心管內。

2. 加 0.2 倍體積的 5X 蛋白酶 K 緩沖液和終濃度至 50 μg/ml 的蛋白酶 K。溫育反應混合液在 37℃ 水浴 60 min。

3. 用 75℃ 水浴 20 min 加熱滅活反應混合液中的蛋白酶 K。

4. 反應混合液用酚: 氯仿與氯仿各抽提一次。

5. 用乙醇沉淀法回收 DNA 擴增產物。加 0.2 倍體積的 10 moI/L 乙酸銨與 2.5 倍體積的乙醇。充分混合液體后，在 4℃ 靜止 30 min。

殘留于 PCR 反應混合液中的 dNTP 能溶解于乙酸銨的乙醇溶液中，但不能隨擴增的目的產物沉淀下來（Okayama and Berg, 1983)。

6. 用微量離心機于 4℃ 以高速（如 12000 g) 離心 5 min 以回收沉淀下來的 DNA。小心棄去上清液，然后用 1 ml 70% 乙醇于室溫洗滌沉淀的樣品，再次離心樣品，棄去上清液，將離心管蓋子敞開，置于室溫，直至乙醇完全揮發。

DNA 樣品可以進一步用填裝樹脂的層析柱進行柱層析純化，如 Wizard PCR preps 純化系統（Promga}、QIA qUick (Qiagen) 或凝膠電泳。這個步驟在通過 PCR 引物介導引入便于克隆的限制性內切核酸酶位點于擴增目的 DNA 片段的兩末端時特別有必要。多余的引物二聚體應在用相應的限制性內切核酸酶進行酶切之前予以去除。

7. 將沉淀下來的 DNA 樣品溶于 TE ( pH 8.0)。一般推測擴增 DNA 樣品的回收率在 50%~80%，溶于 TE ( pH 8.0) 緩沖液中的 DNA 樣品濃度配制成  25 μg/ml ( 25 ng/μl）。

8. 取純化后的 DNA 樣品約 25 ng，并配以相應大小及含量的 DNA marker 進行含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，根據擴增條帶上的熒光強度鑒定 DNA 樣品的實際含量，如果必要，可重新調整這種純化后 DNA 樣品的濃度值。