實驗概要
本方法的目的是從HeLa培養細胞中制備胰蛋白酶分解肽的混合物，這一混合物樣品的主要用于評估，優化和驗證LC-MS/MS程序。
主要試劑
丙酮，Sigma-Aldrich公司(易燃，處理通風柜和戴手套和安全的護目鏡)。
碳酸氫銨，Sigma-Aldrich公司
β-甘油，Sigma-Aldrich公司
糜酶抑素，Sigma-Aldrich公司
DL-二硫蘇糖醇(DTT)，Sigma-Aldrich公司
二甲基亞砜(DMSO)，Fluka公司
乙二胺四乙酸(EDTA)，甘油，BioChemika
高糖DMEM培養基，(Sigma-Aldrich公司)
10%(V / V)胎牛血清(Gibco公司)
碘乙酰胺，Sigma-Aldrich公司(有毒和腐蝕性)
默克亮肽素，Sigma-Aldrich公司
氫氧化鉀，氯化鉀，Sigma-Aldrich公司
L-谷氨酰胺，Sigma-Aldrich公司
賴氨酸- C，Wako Chemicals
Nocodazole，Sigma公司
實驗步驟
1. HeLa細胞蛋白質的制備
1)HeLa-kyoto細胞培養于DMEM中，并用nocodazole過夜處理來抑制生長。
2) 用刮刀收取細胞，并用PBS洗3次。一個托盤(25厘米×25厘米，100毫升介質)能產生約4毫克的蛋白質。
3)將細胞懸液加入至兩倍體積的裂解緩中，并通過細針來抽吸液體破壞其細胞膜。4℃，500 g低溫離心15分鐘，收集蛋白。
2. 丙酮沉淀蛋白質
1) 加入5倍體積的冰丙酮至蛋白溶液，零下30°C孵育。
2) 4℃，500 g低溫離心30分鐘。
3) 棄上清，將蛋白質沉淀與80％的冰丙酮仔細混勻，4℃，500 g低溫離心30分鐘。
4) 將蛋白沉淀晾干(避免完全干燥)，將沉淀溶解于消化緩沖液中(8 M尿素，0.5 M碳酸氫銨)，調整蛋白濃度為5 μg/μL。(注：蛋白質溶液pH值應該為8.0。在我們的實驗室中，用Bradford法測定蛋白濃度)。
3.還原和烷基化蛋白質
1) 向蛋白溶液中0.05 μg的DTT，56℃孵育30分鐘，持續振蕩。
2) 向其中添加碘乙酰胺，使其終濃度為每μg蛋白中含0.25 μg，黑暗中室溫孵育30分鐘。
3) 加入DTT原液至終濃度為每μg蛋白含0.25 μg，停止反應。
4.賴氨酸- C消化
1)將樣品溶解于6 M尿素(含50 mM碳酸氫銨)緩沖液，并添加賴氨酸-C使其終濃度為每50 μg蛋白含1 μg。
2) 30℃孵育2小時，將溶液稀釋至0.8 M尿素含50 mM碳酸氫銨。
3) 每60μg蛋白中加入1μg的胰蛋白酶，37℃孵育2小時。
4) 向樣品中再添加等量的胰蛋白酶，37℃孵育過夜，加入 TFA進行酸化，使樣品的pH值為2來終止消化。
5) 將多肽混合物等量分裝，并存儲在零下80攝氏度環境中。