實驗流程:
1. 收集胰蛋白酶消化的細胞并離心,用PBS清洗。
2. 用100μl 裂解緩沖液冰浴溶解沉淀10min(每500000個細胞20μl裂解緩沖液)。
3. 10000rpm,4°C離心10min,取上清轉移至新管。
4. 用考馬斯亮藍法檢測蛋白質濃度。
5. 用裂解緩沖液將溶液濃度調到5mg/ml,每小瓶中放100μl,-80°C儲存。
6. 按照1:1體積比混合2×樣品緩沖液,煮沸5min后,室溫放置5min。
7. 短時離心后點樣電泳檢測。
溶液準備:
裂解緩沖液:
0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 異丙醇和
5mM ε-氨基己酸
2×樣品緩沖液:
130mM Tris-HCl(pH8.0), 20%(v/v)甘油, 4.6%(w/v)SDS, 0.02%溴酚藍, 2%DTT
PBS(pH7.4):
10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl