副溶血性弧菌檢驗（一）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是廣泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和魚貝類中的海洋性細菌，為海產食品引起急性胃腸炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季節的沿海地區，經常由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產食品，引起爆發性食物中毒。在非沿海地區，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦時有發生。為保障食品衛生質量和食用安全，根據副溶血性弧菌的特性，進行下列檢驗，以便鑒別診斷。

第一節 副溶血性弧菌標準的檢驗方法

一、檢驗方法

（一）操作步驟
1. 分離培養：首先稱取樣品25g，加225mL3.5％滅菌鹽水，用均質器打碎或用乳缽磨碎，接種氯化鈉瓊脂平板和嗜鹽性瓊脂平板各一個，同時取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培養后，涂上述平板進行分離，37℃培養18~24h取出觀察，挑取可疑菌落，轉種3.5％氯化鈉三糖鐵斜面，37℃、24h觀察結果。
2. 涂片鏡檢：將三糖鐵培養基上反應可疑者即底層變黃（葡萄糖產酸不產氣）、上層斜面不變（乳糖、蔗糖不分解）、有動力、不產生硫化氫，進行革蘭氏染色鏡檢形態。
3. 嗜鹽性試驗：將上述可疑培養物分別接種不同含量的鹽胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培養后觀察生長情況，在無鹽和10％鹽的胨水中不生長，在3％和7％鹽的胨水中生長良好者，繼續進行下列有關試驗。
4. 生化試驗：分別接種下列各類生化培養基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基紅、靛基質、V-P，賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸、硫化氫及溶血性試驗，放37℃培養，除V-P、靛基質和甲基紅試驗培養48h后加試劑觀察外，其他均在24h觀察結果。
5. 動物試驗：將上述符合各類反應的副溶血性弧菌，接種3.5％氯化鈉胨水，經37℃、16~18h培養后，小鼠腹腔注射0.3mL，觀察2~3d，將死亡小鼠進行解剖作分離培養。
（二）檢驗程序



圖6-1　副溶血性弧菌檢驗程序

二、結果分析判定及注意事項

（一）樣品處理
采樣時應注意首選準備好滅菌用具及容器，以無菌手續取有代表性的樣品，樣品必須盡快送檢，不宜存放時間過長，副溶血性弧菌在適宜溫度下繁殖較快，但不適于低溫生存，在寒冷的情況下容易死亡，防止待檢材料冷凍，以免影響檢驗結果。
對采取的樣品有時因受存放條件的影響（如低溫冷凍或干燥時間過長等原因），使菌體處于受傷狀態，故需對此類可疑食品或可疑中毒材料進行增菌培養，但應注意為有利于細菌恢復，不宜選用抑制性較強的培養基，否則影響細菌生長。
樣品經增菌8~16h后，轉種平板進行分離，挑選可疑菌落，接種于含有3.5％鹽的三糖鐵培養基，此時挑選數目不應少于5個，尤其夏季海產食品混放，相互污染嚴重，時有不同型別的大量細菌存在，以防漏檢。
（二）形態與染色
為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，易呈多形態，有棒狀、弧狀、卵圓狀、球狀、絲狀等，排列不規則，多數散在，偶而有成對排列，一般大小為0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，單端一根鞭毛，有動力，運動活潑，兩端濃染，在固體培養條件下能生長周鞭毛。
（三）培養特性
在普通瓊脂培養基和普通液體培養基中都可生長，在無鹽的條件下不生長，在含2％~3％氯化鈉的培養基中生長最旺盛，氯化鈉溶液濃度到達10％以上時不繁殖。
在肉湯和胨水等液體培養基中混濁生長，需氧性強，常在液體表面形成菌膜，在液體培養條件下菌體多生長為單鞭毛，運行活潑。在固體培養基上，菌落常為隆起，圓形，稍混濁不透明，表面光滑，濕潤，不產生色素。在比較新鮮濕潤或軟瓊脂培養基上，有些副溶血性弧菌可形成不規則菌落或片狀擴散生長，在0.7％以上瓊脂的培養基上能生長周鞭毛（側毛）。一般在20~25℃培養生長的周鞭毛較為穩定，而在37℃培養或24h以上的培養物，周鞭毛易于由菌體自發脫落，具有周鞭毛的菌株，在固體培養基上多表現擴散生長，單鞭毛的菌株在固體培養基上呈典型菌落，不表現擴散生長。
培養基的成分、種類、溫度、濕度等條件的不同，都能對擴散生長有所影響，菌落形態也容易受條件的影響有所改變，如在嗜鹽性平板上一般生長良好，而在SS瓊脂平板上多呈較小的扁平菌落，不易挑起。在血平反上生長快可出現溶血環，在BCBS（硫代硫酸鹽，檸檬酸鹽，膽鹽，蔗糖）和氯化鈉蔗糖瓊脂平板上，呈淡藍或藍綠色菌落。一般由腹瀉病人初期分離者多為典型菌落，長期保存的細菌或條件不適宜時，常有菌落變粗糙，形狀不整齊或菌落出現解離，有的在液體培養時呈沉淀生長現象。
pH生長范圍為5~10，最適pH為7.2~8.2，發育最適溫度為30~37℃。
（四）生化特性
本菌對葡萄糖產酸不產氣，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，產生靛基質，不產生硫化氫，甲基紅陽性，V-P陰性，賴氨酸陽性，精氨酸陰性，鳥氨酸多數為陽性少數呈陰性，溶血性多數陽性，有少數不溶血，主要生物化學性狀見表6-1。
近年來由于細菌學基礎研究的深入和檢驗技術的進步，逐漸對一些海水來源的嗜鹽性弧菌有所認識，對其主要生化學性狀與副溶血性弧菌的比較見表6-2。

表6-1　副溶血性弧菌的主要生物化學性狀

注：＋陽性；－陰性；＋/－多數陽性，少數陰性。

表6-2　副溶血性弧菌與其他弧菌的鑒別

注：＋90％以上為陽性；－90％以上為陰性；（＋）遲緩陽性；d　11％~89％為陽性；（d）
11~89％遲緩陽性。
（五）溶血性試驗
我妻氏用高鹽血瓊脂培養基，在限定的條件下培養副溶血性弧菌時出現的溶血反應，稱此溶血性能為“神奈川現象”。
此試驗要求是用人或兔的新鮮紅血球制備高鹽血平板，經37℃、24h培養，如在單個菌落周圍呈現透明溶血環或在菌落下面有明顯溶血者，為“神奈川現象”陽性，若不出現透明溶血環或無明顯溶血者，為“神奈川現象”陰性。
有致病性的副溶血性弧菌，多數為神奈川現象陽性，但亦有少數為陰性。
（六）動物試驗
經上述檢驗的可疑菌株，用小鼠測定毒力，將16~18h的蛋白胨水或肉湯培養物，注射小鼠腹腔0.3~0.5mL，有毒力者可在5~10h發病死亡，長者有24h左右發病死亡。發病時有豎毛、運動不活潑，腹部緊貼罐底，呼吸困難，四肢抽搐、尾部痙攣震顫等癥狀。將死亡小鼠解剖后，取心血等內臟進行分離，可檢出試驗菌的純培養。對照動物觀察2~3d無異常現象。
但應注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有時不易區別，需要上述毓的檢驗后，進行毒力證實，綜合判定結果。

三、培養基

　　（一）氯化鈉結晶紫增菌液

制法：除結晶紫外其他按上述成分配好，加熱溶解，約加3％氫氧化鉀溶液4.5mL，校正pH，加熱煮沸，過濾，再加入結晶紫溶液，混合分裝試管，121℃高壓滅菌15min。
（二）氯化鈉蔗糖瓊脂

制法：將牛肉膏、蛋白胨及氯化鈉溶解于蒸餾水中，校正pH，加入瓊脂，加熱溶解，過濾，加入指示劑，分裝燒瓶100mL，121℃高壓滅菌15min備用。臨用前在100mL培養基內加入蔗糖1g，加熱溶化，冷至50℃傾注平板。
（三）嗜鹽菌選擇性培養基

制法：除結晶紫和瓊脂外，其他按上述成分配好，校正pH，加入瓊脂，加熱溶解，再加結晶紫溶液，分裝燒瓶，每瓶100mL。
（四）3.5％氯化鈉三糖鐵瓊脂