一．原理
⑴ 5’-RACE法
① 以目的mRNA 為模板，使用5’末端P 標記的RT 引物進行反轉錄反應，合成1ststrand cDNA。
② 使用RNase H 分解 Hybrid DNA-RNA中的RNA鏈。
③ 使用T4 RNA Ligase 使單鏈cDNA進行環化或形成首尾連接物。
④ 進行PCR擴增。
⑵ 引物設計
二．材料與方法
1 材料
肝臟RNA
2 儀器、用具
PCR儀、0.2ml PCR管、移液器
3 試劑
(1)RNase Free H 2 O；10×RT PCR Bμffer (含dNTP Mixture)；RNase Inhibitor(40U/μl)；AMV Reverse Transcriptase XL (5U/μl)；RNase H (60U/μl)；5×Hybrid RNA Degradation Buffer；5×RNA (ssDNA)Ligation Buffer；T4 RNALigase； 40% PEG#6000
(2)ddH 2 O；10×PCR Buffe；MgCl 2 (25mM)；3 sites Adaptor Primer (20μM)；TaKaRa Taq 酶
(3)TE
(4)無水乙醇（預冷）
4 方法
(1)1st strand cDNA 的合成
② 反轉錄條件為：30℃ 10min；50℃
2)Hybrid RNA的分解
① 按下列組成配制RNA分解反應液：
② 上述反應液中加入1μl 的RNase H，30℃反應1h。
③ 上述反應液加入100μl ddH 2 O，500μl 冰冷的無水乙醇。
④ 混勻，-20℃放置30min，進行乙醇沉淀。
⑤ 14000rpm 離心10min，棄上清。
⑥ 加入500μl的70%乙醇。
⑦ 14000rpm 離心5min，棄上清，干燥沉淀。
(3)單鏈cDNA 環化（連接反應）
① 按下列組分配制連接反應液：
② 在上述沉淀中加入20μ 連接反應液，溶解DNA。
③ 加入20μl 40% PEG#6000，均勻混合。
④ 加入1μl T4 RNA Ligase，16℃過夜反應（15-18h）。
⑤ 連接反應結束后，將連接液用TE Buffer 稀釋10 倍，-20℃保存備用。
(4)PCR 反應
① 1st PCR 反應
a.反應體系：
b．按以下條件進行反應：PCR擴增反應條件：94℃預變性3 min；然后進行25 個循環反應，其溫度循環條件為：94 ℃ 變性1 min ，55℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min；循環結束后 72 ℃ 再延伸5 min。
② 2nd PCR 反應
a．反應體系：
b．按以下條件進行PCR 反應：PCR 擴增反應條件：94℃預變性3min；然后進行30 個循環反應，其溫度循環條件為：94 ℃ 變性1 min，60℃退火1min，72 ℃ 延伸1 min；循環結束后 72 ℃ 再延伸5 min。
c．反應結束后，取 PCR 反應液（5-10μl）進行瓊脂糖凝膠電泳。
(5)將2nd PCR 產物在 1% 瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。回收純化電泳片段克隆到pMD-18T 載體，進行鑒定和序列分析（方法同實驗六、實驗七）。
(6)獲得cDNA 5’末端序列后，將其與cDNA 的核心片斷及3’末端序進行拼接。這就獲得了cDNA的全序列。