動物組織塊DNA的提取

實驗目的

1. 學習并掌握動物組織總DNA的提取方法及其原理。

2. 從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品。

實驗原理

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質變性，然后離心除去變性蛋白質；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

儀器、材料、試劑

儀器

高速離心機；烘箱；冰箱；水浴鍋；微量移液器；高壓滅菌鍋

材料

生理鹽水；十二烷基硫酸鈉（SDS）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；飽和酚；氯仿；異戊醇；無水乙醇；75%乙醇；蛋白酶K；RNase酶；手術剪刀、鑷子、吸水紙；微量取液器；研缽、1.5mL 離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號筆……

試劑配制

1．Tris-HCL 1mol/L PH8.0 50ml

配制方法：40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調PH值到8.0，轉移到50ml容量瓶中，加入雙蒸水定容，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

2．生理鹽水：0.85%NaCL 100ml

配制方法：在20ml雙蒸水中溶解0.85g固體NaCL，加水定容至100ml，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml

配制方法：將9.08g的EDTA?Na2?2H2O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入）調PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA?Na2?2H2O。

4．TES緩沖液（釋放DNA） 100ml

配制方法：將0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

5．10% SDS（變性劑 破細胞壁）100ml

配制方法：將10g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于80ml雙蒸水于68℃加熱溶解，用濃HCl調至PH=7.2，定容至100ml，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，4℃保存備用。

6．蛋白酶K（降解蛋白質）：20mg/mL 無菌三蒸水溶解。

7．RNA酶 （降解RNA）

配制方法：將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris?CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份存于?20℃。

8．氯仿：異戊醇=24：1 100ml

按24:1的比例加入氯仿、異戊醇，搖勻，轉到準備好的瓶中，貼上標簽，4℃保存備用。

9．TE緩沖液（溶解DNA） PH8.0 50ml

配制方法：將0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中，調PH8.0定容至50ml搖勻后，轉到準備好的瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

實驗步驟

1．組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5g組織，放入1.5ml離心管中，剪碎。

2．加入0.45ml TES混勻，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混勻后，于56°C保溫4-6h，每2h搖1次。

3．放置到室溫，加入等體積飽和酚（500ul），顛倒混勻，10000r/m，離心10m，分離水相和有機相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個新的1.5ml離心管。

4．加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層轉移到新的1.5ml離心管中。

5．加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層清液到一個新的1.5ml離心管。

6．加入2.5倍體積的-20°C預冷的無水乙醇沉淀DNA，觀察現象。

7．12000 r/m，離心10分鐘，棄乙醇。

8．-20°C保存的75%乙醇洗滌，10000 r/m，離心5分鐘，去乙醇，55°C干燥DNA。

9．加入適量TE溶解DNA（具體依DNA的多少而定），-20°C保存備用。

注意事項

1．抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。

2．取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。

3．乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

4．離心后，不要晃動離心管，拿管要穩，斜面朝外。