一、實驗原理
RNA是基因表達的中間產物，存在于細胞質與核中。對RNA進行操作在分子生物學中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA
是很多分子生物學實驗所必需的，如Northern雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于RNA的質量。由于細胞內的大部分RNA是以核蛋白復合體的形式存在，所以在提取RNA時要利用高濃度的蛋白質變性劑，迅速破壞細胞結構，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。再通過酚、氯仿等有機溶劑處理、離心，使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總RNA。在提取的過程中要抑制內源和外源的RNase活性，保護RNA分子不被降解。因此提取必須在無RNase的環境中進行。可使用RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源RNase活性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質變性劑，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。
本實驗介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動物組織總RNA并通過電泳進行鑒定。
二、儀器和試劑
1.儀器：
超凈工作臺、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統、振蕩器、移液器、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、
玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃ 烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。
2.試劑：
(1)細胞裂解液：
異硫氰酸胍 4mol/L
檸檬酸鈉（pH7.0） 25mmol/L
十二烷基肌氨酸鈉 0.5%
β-巰基乙醇 0.1mol/L
稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存備用。
(2)10×凝膠緩沖液：
嗎啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/L
NaAc 100mmol/L
EDTA(pH 8.0) 10mmol/L
過濾除菌后避光保存。
（3）5×變性上樣緩沖液：
水飽和的溴酚藍 16μl
500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl
甲醛（37%） 720μl
甘油 2ml
甲酰胺 3084μl
10×凝膠緩沖液 4ml
加無RNase水至10ml，4℃可保存3個月。
（4）TRIzol RNA抽提試劑
（5）2mol醋酸鈉
（6）0.1% DEPC
(7)平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）
（8）平衡酚、氯仿
（9）無水乙醇、70%乙醇、異丙醇
(10)無RNase水
三、操作步驟
（一）異硫氰酸胍法（PLT）
1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預冷的細胞裂解液1ml,在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一試管中。
2.加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。
3.加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。
4.將混合物轉移至1.5ml Ep管中，4℃，離心10 000r/min,20min.
5.移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20℃，30min沉淀RNA.
6. 4℃，離心12 000r/min，15min.
7. 棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃ 離心10 000r/min，10min。
8. 棄上清液，自然干燥，但應避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。
9.加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），?C70℃保存