動物細胞培養—清洗與滅菌

實驗概要

本實驗介紹了用于細胞培養的各種器皿的清洗與消毒，有助于掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。

實驗原理

清洗與消毒是組織培養實驗的第一步，是組織培養中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養不好與清洗不徹底有很大關系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質。如有毒的化學物質，哪怕殘留0．1個，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養價值、生物學特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

主要試劑

70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0．5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業)，DEPC水[體積分數0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。

主要設備

無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22 μm，過濾器(直徑25)；超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

實驗步驟

清洗：

1．新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質和其他有害物質。

2．使用過的玻璃器皿的清洗

   1) 使用過的培養用品應立即浸入清水，避免干涸難洗。

   2) 用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數遍，倒置自然干燥。

   3) 浸酸性洗液過夜。

   4) 從酸性洗液撈出后自來水沖洗10-15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。

   5) 包裝(牛皮紙或一般紙)。

   6) 高壓(15磅20 min)或干熱(170℃2 h)滅菌。

   7) 貯存備用。

3．膠塞的處理

   1) 新膠塞應先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l0-20 min。

   2) 自來水清洗10次。

   3) 再用1％稀鹽酸浸泡30 min。

   4) 自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。

消毒：

1．物理消毒法

   1) 紫外線消毒用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養器皿，如塑料培養皿、培養板等。這是常使用的消毒方法之一。

   2) 干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養的器皿放人干燥箱內，加熱至160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5－8 h。

   3) 濕熱滅菌此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下：

      ① 首先查看高壓鍋內的水是否充足，放人物品蓋好蓋。

      ② 加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以排除鍋內的冷空氣。

      ③ 待鍋內水沸騰后，落下放氣閥繼續升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。調節火力大小保持該壓力。

      ④ 停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。

電熱自動滅菌鍋使用說明(型號：SANYO Autoclave MLS-3020)：

      ① 放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。

      ② 打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。

      ③ 打開電源。

      ④ 設定高壓溫度及時間，高壓鍋的溫度范圍為105－121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。

      ⑤ 把待高壓的物品置于高壓鍋內，順時針方向將exhaust鈕旋至close位置。

      ⑥ 關閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點剛出現為止。

       ⑦  按start鈕，開始高壓，在溫度達80℃時顯示器開始顯示溫度，當溫度達到所需的設定溫度時，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時間結束后指示燈滅，此時蜂鳴器報警一聲。當壓力降至0  MPa時，蜂鳴器再報警一聲。溫度降至80℃時，蜂鳴器報警10次。顯示屏溫度指示消失，此時才可打開鍋蓋。

      ⑧ 關電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。

    4)  濾過除菌用于培養用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90  mm、100 mm、142 mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20 mm、25  mm等)。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22  μm除菌最為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

      ① 在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm。

      ② 用布包好，濕熱滅菌后使用。

2．化學消毒法

常用的消毒液有如下幾種：

   1) 70％(或75％)酒精：超凈臺里常備70％酒精棉球(衛生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。

   2) 0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。

   3) 來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。

   4) 0．5％過氧乙酸：是強效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。

   5) 乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d。可將空氣中漂浮的微生物殺死。

   6) 37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達到消毒空氣的目的。

3．煮沸消毒急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。

注意事項

1．清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。

2．干熱滅菌時，應在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發生意外。當溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。．

3．高壓滅菌后器皿務必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發霉。

4．牛血清、大部分培養基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。

5．濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應待濾器溫度降至室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。

6．使用化學消毒法時，配制75％酒精應用衛生級，不要用化學純、分析純和優質純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時，所有的物品要事先準備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴重的刺激和傷害作用。