動物細胞基因組DNA提取實驗

實驗原理

真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內，制備DNA將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，同時保持DNA分子的完整。提取DNA的過程是指將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。

在提取DNA的反應體系中，SDS用于細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase活性；而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使起與DNA分子分離開來。

實驗材料

（1）細胞裂解緩沖液：  

Tris (pH8.0) 100 mmol/L ；EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L； NaCL 20 mmol/L； SDS 10% ；胰RNA酶 20ug/ml。

（2）蛋白酶K： 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，用一次性過濾器過濾除菌，-20℃備用。

（3）TE緩沖液（pH 8.0），高壓滅菌后室溫貯存。

（4）酚：氯仿：異戊醇=25:24:1（體積比）。

（5）NaAc 3 mol／L。

（6）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

實驗過程

1、取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。放入勻漿器中，加入2ml細胞裂解緩沖液，然后充分研磨，至不見明顯組織塊，然后轉入1.5ml 離心管中，以12000 rpm離心5min。

2、棄掉上清，加入0.4ml細胞裂解緩沖液，迅速吹散沉淀。加入20ul蛋白酶K（0.2mg/ml），混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，或轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

3、加入等體積酚：氯仿：異戊醇抽提一次，溫柔混勻。4℃條件下，10000rpm，離心10min。

4、輕輕吸取上層液面，注意不要吸到兩層之間的白色沉淀。如上層液面中白色沉淀較多或渾濁可以再次加入等體積酚：氯仿：異戊醇抽提一次。

5、向吸取的上清液中加入1/10體積的NaAc，輕柔混勻，然后加入2.5倍體積的-20℃預冷的無水乙醇，輕柔混勻后，-20℃冰箱中沉淀過夜。

6、12 000rpm 離心 20min，棄上清；加入-20℃預冷的75％乙醇，12000rpm 離心 15min 室握溫干燥，加入適量無菌水溶解基因組DNA，存放于 4℃，如溶解不充分可輕搖溶解過夜。

注意事項

1、選取的組織須是新鮮材料，且處理時間不宜過長。

2、操作過程盡可能在低溫條件進行，避免基因組DNA降解或斷裂。

3、使用酚：氯仿：異戊醇，乙醇抽提或沉淀DNA時須輕柔操作，避免DNA降解或斷裂。

4、實驗中會使用到有機試劑，須注意防護，并在通風條件下進行操作。

常見問題及分析