動物骨髓細胞有絲分裂染色體制片材料、原理和步驟1

實驗九 動物骨髓細胞有絲分裂染色體制片

一、實驗目的：

了解動物細胞染色體制片的原理，學習骨髓細胞染色體的制片方法，觀察動物細胞染色體的數目和形態。

二、實驗原理：

染色體是基因的載體。真核細胞染色體的數目和結構是重要的遺傳指標之一。制備染色體標本是細胞遺傳學最基本的技術，優良的染色體制片是進行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。

　　染色體的制備在原則上可以從所有發生有絲分裂的組織和細胞懸浮液中得到。最常用的途徑是從骨髓細胞、血淋巴細胞和組織培養的細胞中制備染色體。

　　小型動物的染色體制片最好最有效的材料就是骨髓組織。利用骨髓的制片技術雖然需要離心以及細致的操作，但其基本程序是簡便的。另外，在骨髓細胞中，有絲分裂指數相當高，因此可以直接得到中期細胞而不必象淋巴細胞或其它組織那樣要經過體外培養。主要的中期相來自成紅細胞系統，也來自各種骨髓母細胞，單核細胞和淋巴細胞的分裂相是較少的。不過，在染色體制片上已無法區別上述來源。多倍體的中期相（4n、8n和16n）往往來自于巨核細胞。

　　對大型動物通常采用對骼骨、脊或胸骨穿刺術吸取紅骨髓，小型動物多采用剝離術取股骨以獲得骨髓細胞。通過骨髓得到的染色體是比較簡便的，一般也無需無菌操作。在臨床上多用于白血病的研究。在實驗條件下，這種染色體是機體內真實情況的反映，因此在藥品檢驗、環境監測、食品檢驗等工作以及致畸、致癌、致突變等研究中，利用骨髓制片的方法易于觀察毒性物質在體內對細胞和染色體的影響。

　　不過，在有些情況下，穿刺取骨髓較困難，或者希望對同一個體材料進行連續的對比取材，以觀察藥物或環境因素對人類或動物的影響及染色體的動態變化。這時，采用外周血細胞而不傷害供血者直接制備染色體的技術就十分有利了。

三、實驗步驟：

1．前處理：兩棲類是變溫動物，因此氣溫低時，代謝慢，分裂相較少。所以一般在氣溫較高的季節做。如果氣溫較低時操作，可于實驗前25℃預培養一周時間以提高蟾蜍的細胞活動性，增多分裂細胞相。取骨髓細胞前5－8小時向蟾蜍腹腔內注射秋水仙堿溶液。（每10克體重注入10-30μg秋水仙堿）

2. 雙毀髓法處死蟾蜍，剖出股骨，將股骨上的肌肉用1％檸檬酸鈉溶液洗凈；

3．剪去股骨兩端，用注射器吸取生理鹽水溶液1ml，將針頭插入骨髓腔，以有1％檸檬酸鈉溶液將骨髓細胞沖入離心管中(注意預溫藥液至25℃)，反復吹洗直至骨腔變白；

4．用吸管反復吹打骨髓細胞懸液幾次，即得單細胞懸液；

5．將所得的骨髓細胞懸液1000rpm離心10分鐘，吸去上清液，加預溫至25℃的0.075mol/L KCl 5～8ml，立即用吸管吹打均勻，25℃條件下靜置低滲20分鐘。

6．往低滲處理后的細胞懸液中加入2-3滴甲醇－冰醋酸固定液，吹打均勻進行預固定；

7．1000rpm離心10分鐘，去上清，沿管壁加 5～8ml甲醇-冰醋酸（3∶1）固定液，立即吹散打勻，靜置15分鐘后用吸管再吹打一次，打散細胞團塊。再靜置15min
8. 1000rpm離心10分鐘，去上清，留約0.1～0.2ml的沉淀細胞和上清液，視細胞多少可再加甲醇-冰醋酸（1∶1）固定液2～3滴，用吸管反復輕吸混勻，制成細胞懸液。

9．取冰箱中預冷的潔凈載玻片，30°傾斜，用吸管吸取一滴上述細胞懸液，于載玻片上適當高度滴在載玻片上，立即吹散吹勻細胞，擴散平鋪于玻片上，空氣中自然干燥。

10．載玻片充分干燥后，用pH6.8的磷酸緩沖液按1份Giemsa原液9份磷酸緩沖液混勻后染色。材料面向上，用染液覆蓋載玻片，染色10～15分鐘，用流水洗去多余染液，再用吸水紙吸干多余水分，干燥后即可鏡檢。

注：
1. 在高倍顯微鏡下觀察蟾蜍骨髓淋巴細胞的染色體。我們可能看到有11對(2n=2×11＝22)等臂的染色單體，每一條都呈V字形。牛蛙的體細胞染色體數目2n=26,其中有5對大型染色體和8對小型染色體。