動物RNA提取實驗

SV Total RNA Isolation System (SV 總RNA 純化系統)可在1小時內從組織、培養細胞和白細胞中提取純化完整總RNA，方法簡單、快速。該系統以膜為基礎，根據組織類型的不同，每次最多可純化60 mg 組織。系統包含DNase 處理步驟，直接在小離心柱的濾膜上完成，大大降低了會干擾擴增反應的基因組DNA 的污染。純化中不需使用苯酚: 氯仿抽提及乙醇沉淀，最后RNA 樣品中沒有DNase 殘留。

實驗魚

乙醇 DEPC SV RNA Lysis Buffer SV RNA dilution Buffer SV RNA Wash Solution Yellow core Buffer MnCl2 0.09M DNase Ⅰ SV DNase Stop Solution Nuclease-Free water

臺式離心機 恒溫水浴鍋 分析天平 移液器 一次性注射器 方盤 鑷子 手術剪 培養皿 離心管

一、材料準備
 

1 .  材料

實驗魚，購于市場。
 

2 .  儀器、用具

臺式離心機、恒溫水浴鍋（70℃）、分析天平、移液器、一次性注射器、方盤、鑷子、手術剪、培養皿、1.5 ml離心管。
 

3.  試劑

95%的RNase-free乙醇；0.1%DEPC處理水；SV RNA Lysis Buffer；SV RNA dilution Buffer；SV RNA Wash Solution；Yellow core Buffer；MnCl₂  ；0.09 M；DNase Ⅰ；SV DNase Stop Solution；Nuclease-Free water。

4.  材料處理
 

（1）將培養皿、剪刀、眼科鑷滅菌，-20℃預冷。
 

（2） 用泡沫盒盛裝碎冰，將培養皿置于冰上，將剪刀、鑷子置于培養皿中。
 

（3） 用桶盛裝碎冰，加入少量的自來水，用紗布包裹魚放入桶中。
 

（4）將已麻痹的魚置于方盤中，用剪于肛門向前及斜向上將腹腔剪開，取出內臟，分離肝臟置于培養皿中。
 

（5） 取1.5 ml的離心管于分析天平上，調零。
 

（6）用鑷子取20-30 mg的肝臟組織于1.5 ml的離心管中，稱重。
 

二、 實驗操作
 

1.   取約30 mg組織于1.5 ml 離心管中，加入175 μl SV RNA Lysis Buffer，用一次性注射器將組織壓碎、反復抽打混勻。

2.  加350 ul SV RNA Dilution Buffer（藍色），翻轉管子3-4 次混勻，置70℃水浴3 min。

3.   冰上冷卻1-2秒，14 000 rpm離心10 min，上清液移入一新離心管。
 

4.  加入200 ul 95%的乙醇，槍頭混勻。
 

5.  將上述混合液移入Spin Basket Assembly，14 000 rpm離心1 min，棄濾液。
 

6.   加入600 μl SV RNA Wash Solution（with ethand added），14 000 rpm離心1 min，棄濾液。
 

7.   在一新離心管中配制DNase incubation mix：

Yellow Core Buffer    40 ul

MnCl2 0.09M     5 ul

DNase Ⅰ     5 ul
 

8.  將上述50 ul 混合液直接加在Spin Basket的膜上，室溫（20-25℃）保育15 min。
 

9.   加200 ul SV DNase Stop Solution（with ethand added）至Spin Basket 14 000 rpm，離心1 min。
 

10.   加600 ul SV RNA Wash Solution，14 000 rpm離心1 min，棄濾液。
 

Yellow core Buffer 40 ul  MnCl₂，0.09M 5 μl   DNase I 5 ul
 

11.   加250 ul SV RNA Wash Solution，14 000 rpm離心2 min，將Spin Basket轉移到一新離心管中。
 

12.   加50 ul Nuclease-Free Water 至膜上，14 000 rpm離心1 min，溶解RNA，-20℃保存。
 

13.   取5 ul RNA樣品，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。

1. 實驗室用的普通玻璃制品和塑料制品經常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿沖洗(塑料制品)。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用滅菌水淋洗數次，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H₂O₂溶液10min，然后用0.1%DEPC水徹底沖洗電泳槽。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理。

2. 在RNA提取過程中,應戴一次性手套,對接觸可能污染的器皿時，應勤換手套。

3. 配制的溶液應盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對不能高壓滅菌的試劑，用經DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22μm濾膜過濾除菌。

一、RNA提取介紹

通常一個典型的哺乳動物細胞約含有10-5 ug RNA ，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18S和5.8 S、5S四種類型）；10%～15%為tRNA和核內小分子RNA。
 

這些高峰度的RNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離。相反，占RNA總量1%～5%的為mRNA 。mRNA 雖然大小和核苷酸序列各不相同，從數百至數千堿基不等，但大多數真核細胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo(dT)] ，使得mRNA可以利用親和層析法分離。這個群體編碼了所有由該細胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩定，易于降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩定，故在提取RNA時關鍵因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內源RNA酶的活力，因此，創造一個無RNA酶的環境，嚴格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關鍵。
 

對內源性RNA酶，主要運用RNA酶抑制劑，目前常用的RNA酶抑制劑有：
 

①RNA酶的蛋白質抑制劑(RNasin)，它是從人胎盤分離的一種蛋白質，可以與多種RNA酶緊密結合形成非共價結合的復合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質抑制劑制品經數次凍融后或放在氧化條件下應棄之不用。RNA酶的蛋白質抑制劑不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯；
 

②氧釩核糖核苷復合物，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是一種過渡態似物，它能與多種RNA酶結合并高效抑制RNA酶活性。然而氧釩核糖核苷復合物能強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
 

③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后續的RNA純化過程中經離心除去；
 

④異硫氰酸胍，它是強力的蛋白質變性劑，在破壞細胞結構使核酸從細胞核中解離出來的同時也使RNA酶變性失活；
 

⑤焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理；
 

⑥其它化學試劑，如SDS、尿素等對RNA 酶也有一定的抑制作用。
 

對外源性RNA酶主要通過以下幾個途徑污染RNA制品：
 

①玻璃制品、塑料制品和電泳槽；
 

②研究人員造成的污染；
 

③污染的溶液。
 

因此在實驗中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶：
 

①實驗室用的普通玻璃制品和塑料制品經常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿沖洗(塑料制品)。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2 h，然后用滅菌水淋洗數次，并于100℃干烤15 min。

RNA電泳槽需用去污劑洗滌，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H₂O₂溶液10 min，然后用0.1%DEPC水徹底沖洗電泳槽。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理；
 

②在RNA提取過程中，應戴一次性手套,對接觸可能污染的器皿時，應勤換手套；
 

③配制的溶液應盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12 h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對不能高壓滅菌的試劑，用經DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22 um 濾膜過濾除菌。