下面這個典型流程對許多蛋白質都有很好的效果。本 操 作 方 案 是 根 據 N g u y e n 等(1993)首先開發的方案改編而成，并用于冷泉港蛋白質純化與鑒定課程的不溶性重組蛋白純化部分（Burgess and K n u t h ， 1996)。其他類似的流程也可能給出相似的結果，但我們實驗室幾乎只使用該流程。下面我們將會對關鍵步驟進行討論。
(1) 使 用 含 有 I L L B 培養基的2 L 培養瓶, 在 37°C 、振搖條件下培養攜帶了 p E T 載體 (克隆有目標基因）的 大 腸 桿 菌 B L 21(D E 3)p L y S 菌 株（Studieretal.， 1”0), 直 A600nm達 到 0.6。
(2) 加人異丙基-β-D-硫化半乳糖苷(I P T G ) 至 0. 5? I m m o l /L ，誘 導 T 7 R N A 聚合酶的表達，然后該酶進行目標基因的轉錄。
(3) 誘 導 3?4 h 后 ，15 000 r/min 離 心 15 min以收獲細胞，用小體積的培養上清液重懸細胞，然后將其轉移至預先稱重的40 mL橡樹嶺(Oak Ridge)離心管中, 離心以沉淀細胞。記錄細胞沉淀的濕重，并凍存于一80°C 待用 。用 此 方 法 一 般 每 升 可 得 到 1.5?2.0 g濕重的大腸桿菌細胞。
(4) 解凍細胞，用 30 m L 裂解緩沖液[50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7. 9)，0.1 mmol/ LEDTA,5% 甘油，0.1mmol/L DTT,0.1mol/L NaCl]重懸，然 后 用 60% 的 功 率 超 聲 3次或 4 次 ，每 次 20 s ，每次間隔 I m i n 于冰上冷卻。
(5) 加入純的 Triton X -100(來 自 1 0 % 的質量體積濃度的儲存液)至 1 % 以分解細胞膜和溶解膜蛋白。將裂解物于冰上孵育10 m i n ，然 后 15 000 r A n i n 離 心 15 m i n 以沉淀包涵體 ，最后移走可溶性上清液。
(6) 用 30 m L 含 1 % Triton X -100的裂解緩沖液重懸包涵體，冰上孵育10 m i n ，然后15 000 r /m i n 離心 15 m i n 。
(7) 將去除了上清液的包涵體沉淀用30 m L 不 含 Trinton X -100的裂解緩沖液重懸以去除 Trinton X -100, 然后同上條件離心。得到的沉淀稱為洗滌后的包涵體成分，其純度通常高于9 0 % 。
(8) 將洗滌后的包涵體沉淀重懸于合適的變性劑，并 孵 育 使 之 變 性 和 溶 解 ，然后15 000 r/m i n 離 心 15 m i n 以除去任何殘余的不溶物。我們通常使用上述裂解緩沖液 (如果 用 鹽 酸 胍 稀 釋 則 不 含 N a C l ) ，同 時 加 人 6 m o l/L 鹽 酸 胍（guanidine hydrochloride，G u H C D ，8 m o l/L 尿素（urea)或 0 . 3 % 十 二 烷 基 肌 氨 酸 鈉 [或 稱 為 N -月桂酰肌氨酸鈉(sarkosyl 或 n-lauroyl sarcosinate)]以使包涵體溶解。
(9) 最近，我們采用了一種相對簡單的重折疊實驗(見下文）以鑒定出合適的重折疊緩沖液。
(10) 將變性樣品中的蛋白質濃度調整至I m g /m L 。
(11) 將變性蛋白質稀釋15?6 0 倍, 以使變性劑濃度降低至蛋白質可以進行重折疊的程度。通常我們或是快速地稀釋，或是緩慢地將變性的包涵體蛋白滴加至燒杯中的重折疊緩沖液中，同時劇烈攪拌以快速混勻。稀釋過程在室溫下進行，混勻完成后, 將溶液靜 置 1?2 h 以保證重折疊過程的完成，同時也使聚集物形成并出現絮凝物。
(12) 用蛋白質低親和的 0. 22um 濾膜(如 Stericup——GV 0. 22 m m o l /L ， 500 m L ，Millipore # S C G V U 05R E )過濾重折疊的蛋白質溶液以去除顆粒狀物質（如果有明顯的沉 淀 ，其可能會堵塞濾膜，可在過濾之前進行離心)。
(13) 將過濾后的溶液盡可能快地(要在柱子和系統壓力限制容許的范圍內，希望至少 10 mL/min)栗 入 10? 15 m L 的 離 子 交 換 層 析柱 。如 果 條 件 允 許 ，監 測 280 nm、260 nm和 320 m n 處的吸光度。其 中 320 n m 處的光吸收用于測量光的散射, 對于某些蛋白質來說，它可顯示多聚體形成的峰。
(14) 用 5?1 0 個柱體積的添加了 〇? I m o l / L N a C l 的 緩 沖 液 A [50 m m o l / L Tris-HCL(pH 7 . 9 ) ，5 % 甘 油 ，〇 . 1 mol/L EDTA, 0.1mmol/L DTT] 沖 洗 柱 子 ，然 后 用 1 0 個柱體積的在相同緩沖液中的0. 1?1. 0 m o l / L N a C l 的線性梯度洗脫，流 速 為 5 m L /m i n ，每 份 收 集 3?4： m L 。
(15) 用 S Ds- P A G E 分 析 280 n m 的吸收峰, 確定不同收集組分的純度。如果能夠進行酶活性分析，那么分析各收集組分以確定具有最髙特異性活性的組分。
(16) 混合各收集峰，用 含 5 0 % 甘油的裂解緩沖液透析，然后凍存于一20°C 或一80°C 。
(17) 鑒定混合的收集峰。如果可能, 將其特異性活性與該蛋白質標準樣品的活性進行比較，該標準品的制備使用的是不涉及重折疊的更常規的方法。