北京大學湯富酬等團隊發布單細胞測序技術最新研究成果

　　基于第三代測序（TGS）平臺的單細胞RNA-seq技術的進步加速了生物學研究。自2016年以來，已經開發了幾種基于TGS平臺的單細胞RNA-seq方法。由于受到低準確度和靈敏度的限制，它們要么結合基于NGS平臺的方法降低錯誤率，要么通過犧牲通量來提高檢測率。

　　2023年1月11日，北京大學湯富酬等團隊合作在《Cell Discovery》在線發表題為“High-throughput and high-sensitivity full-length single-cell RNA-seq analysis on third-generation sequencing platform”的研究論文，該研究在第三代測序平臺上進行了高通量、高靈敏度的全長單細胞RNA-seq分析。

　　研究概述

　　為了克服上面的問題，研究人員開發了SCAN-seq2一種基于TGS平臺的高通量，高靈敏度的全長RNA-seq方法。研究對來自九個細胞系的總共5472個細胞進行了SCAN-seq2，顯示了數據處理管道的詳細流程圖以及過濾、解復用和重復數據刪除后讀取的總體統計數據。

　　通過參考引導的轉錄組組裝，研究人員鑒定了數千種新型全長RNA亞型。假基因的轉錄本可以與相應親本基因的轉錄本區分開來，其中數百個顯示出細胞類型特異性表達模式。此外，研究發現可以準確確定高度多態性T細胞受體（TCR）和B細胞受體（BCR）基因（免疫球蛋白）的V（D）J重排事件。最后，研究證明了HepG2和Hela細胞在剪接體抑制劑異銀杏素（IGG）處理后的保守凋亡反應。SCAN-seq2被證明是單細胞全長轉錄組研究的一種新的有前途的工具。

　　研究進展

　　在SCAN-seq2中，每32個具有不同3 '條形碼的單細胞的第一鏈cDNAs在逆轉錄后聚集在一起。通過在PCR引物中引入24-nt條形碼，在PCR擴增過程中加入不同的5 '條形碼。通過這種方法，該研究一次測序最多可以測序3072 (32 × 96)個單細胞。從平均的角度來看，當對960個細胞進行測序分析時，研究人員在每個細胞中檢測到超過4000個基因和4500個組裝良好的RNA異構體。每個24 bp條形碼的序列錯誤數總體上小于3，遠低于96個不同條形碼的編輯距離(11個堿基)。

　　研究還比較了通過SCAN-seq2和基于NGS的方法鑒定的同一文庫的ERCC UMI。當編輯距離為1時，86%的SCAN-seq2 UMI可以分配給相應的NGS UMI，驗證了SCAN-seq2 UMI的合理質量。這些結果表明，SCAN-seq2具有高通量和高靈敏度。

　　然后，研究人員評估了交叉污染的水平。經過嚴格的質量控制，來自Library 4CL的所有細胞的讀數基本上與小鼠或人類參考轉錄組正確比對，只有一個細胞（0.28%）被鑒定為受污染，證實了SCAN-seq2的低交叉污染率。添加 UMI 后，SCAN-seq2 實現了與黃金標準方法 Smart-seq3 相當的精度。在所有5個文庫中，UMI計數與實際ERCC濃度之間的Pearson相關系數均高于0.85。SCAN-seq2和Smart-seq3合并數據對全局基因表達的相關性為0.83，驗證了這兩種方法的一致性。此外，每對單個細胞之間的平均相關性達到0.95，與Smart-seq3一樣高，表明SCAN-seq2具有很高的重現性。

癌細胞系中異銀杏素（IGG）反應的SCAN-seq2技術性能和分析

　　SCAN-seq2也可用于研究TCR和BCR，其中轉錄本是在可變（V），多樣性（D）和連接（J）基因片段重組后產生的。在H9和GM12878中均檢測到大量抗原受體編碼轉錄本。對于TCR，在H9細胞中僅檢測到基因TRAC和TRBC1的轉錄本，表明TCRαβ基因的表達。我們發現基本上所有的H9細胞對β鏈都具有相同的V（D）J重排，TRBV13作為V元素，TRBD263作為D元素，TRBJ1-2作為J元素。正如預期的那樣，沒有檢測到α鏈的D元素。進一步鑒定了兩個亞克隆，對應于α鏈的兩個VJ重排。GM12878的BCRs亞克隆之間的主要區別在于重鏈，而輕鏈基本相同。我們鑒定的最大GM12878克隆與GM12878免疫球蛋白的“真實基因注釋”完全一致5.這些結果證明，SCAN-seq2可以準確確定恒定區域的TCR和BCR基因轉錄本和V（D）J重組，從而可以在單細胞分辨率下準確檢測T細胞和B細胞的克隆多樣性。

　　研究意義

　　總而言之，相比其他已發表的基于TGS平臺的scRNA-seq方法，SCAN-seq2同時表現出高通量和高靈敏度。作為一種全長測序方法，SCAN-seq2可以獲得更均勻的轉錄本信息，而不會發生片段和富集。因此，為了獲得全長轉錄本每個片段的相同覆蓋率，SCAN-seq2所需的測序深度可能遠低于短讀長測序。作為一種更方便的工具，SCAN-seq2可用于以單細胞和單個RNA亞型分辨率研究不同的生物系統，并幫助了解許多疾病的復雜機制。