北大魏文勝課題組：提高基因敲除效率的新方法

　　基因組編輯技術，可讓科學家們能夠在各種哺乳動物細胞系中實現基因敲除。然而，用一種典型的方法，以一種及時的方式，完全破壞一個靶基因，在技術上是具有挑戰性的。為了提高產生可靠基因組修飾的效率，北京大學生命科學學院魏文勝課題組，設計了一種方法，其使用一個線性供體片段，該片段包含一個報告系統。結合一種不依賴于同源重組（HR）的敲入策略，研究人員成功地富集了特異性攜帶靶基因突變的細胞克隆。相關研究結果發表在11月1日的《FEBS Letter》雜志。

　　基因組編輯技術徹底改變了基因功能的實驗性研究。三大主要技術：ZFN（鋅指核酸酶）、TALENs（轉錄激活因子樣效應物核酸酶）和CRISPR / CAS系統，采用不同的機制來產生序列特異性雙鏈斷裂（DSB），隨后觸發本地修復系統來完成序列特異性的修飾。這些強大的技術在功能基因研究、染色體位點的動態和實時成像、疾病突變的糾正、基因療法中有著廣泛的應用。

　　CRISPR / Cas系統由于其效率高、易操作，而變得尤為流行。然而，雖然CRISPR / Cas系統在基于設計和序列特異性的基因組研究中具有前所未有的力量，但它在哺乳動物細胞中產生基因敲除的簡單任務，在技術上仍然是有挑戰性的。

　　科學家們已經作出了各種努力，來提高產生基因敲除的效率。然而，各種缺點限制了這些技術的一般和廣泛應用，甚至敲除一個單一基因有時是一個漫長、繁瑣和高風險的過程。特別是，在哺乳動物細胞中產生多基因敲除，仍然是一項艱巨的任務。

　　如果靶基因中斷產生的表型變化，可用于富集，就很容易得到基因敲除的克隆，如HeLa CSPG4?/?細胞賦予艱難梭菌毒素B抗性。然而，這種策略不能普遍應用。獲得基因敲除的傳統方法是把表達Cas9和sgRNA的質粒，與表達耐藥性或熒光蛋白的質粒共轉染，但這個選擇不會增加突變率或富集包含靶修飾的那一小部分細胞。

　　先前已有研究報稱，如果一個同源等位基因被修改，靶等位基因的突變頻率一般是很高的。該研究小組認為，如果我們可以在其中一個靶等位基因上的特定位點插入一段供體序列，并選擇表達供體遺傳標記基因的克隆，我們就能夠富集這些罕見的事件，其中所有的等位基因是被修改的。已有研究表明，外源dsDNA片段可通過不同的修復機制，被整合到具有雙鏈斷裂（DSBs）的染色體位點中。比起通過同源重組修復（HR），通過NHEJ介導的DNA修復，一般具有更高的整合效率。為了確保供體序列的插入效率，并避免克隆長側翼序列克隆的麻煩，該研究小組使用CRISPR/Cas9引發的HR獨立性DNA修復，來介導外源線性供體DNAs的插入。

　　結合不依賴于同源重組（HR）的敲入策略，該研究小組成功地富集到那些特異性攜帶靶基因突變的細胞克隆。當把這種特殊程序與CRISPR/Cas9系統相結合使用，員在一步式程序中產生單個和多個基因敲除時，研究人員觀察到了大大提高的成功率。這種新的方法進一步增強了基因及其功能的分子生物學研究。