華中農大：利用I型及III型CRISPRCas系統實現基因組編輯

　　CRISPR-Cas系統廣泛存在于細菌和古細菌中，近年來科學家們針對它們的分子機制開展研究促使開發出了基于II型系統的一些基因編輯技術(延伸閱讀：中科院Cell發表CRISPR-Cas研究新成果 )。然而，卻未有研究報道利用I型及III型系統來實現基因組編輯。

　　來自華中農業大學的研究人員報告稱，他們開發出了一種利用I型和III型CRISPR進行基因組編輯的方法，實現了對冰島硫化葉菌 (Sulfolobus islandicus)的遺傳操控。這項研究發布在10月13日的《Nucleic Acids Research》雜志上。

　　華中農業大學的佘群新（Qunxin She）教授和梁運祥（Yun Xiang Liang）教授是這篇論文的共同通訊作者。博士生李英俊（Yingjun Li）為論文第一作者。

　　CRISPR-Cas在原核生物抗病毒防御中發揮重要功能，分別存在于90%和40%的古細菌及細菌基因組中。當前，CRISPR-Cas主要被分為3個主要類型：I型，II型和III型。CRISPR-Cas系統按三個步驟來發揮功能。首先，識別來自入侵遺傳元件的一段DNA（前間隔序列，protospacer），并將其插入到前導序列之后的CRISPR位點，變為CRISPR序列第一個新間隔序列。第二步，前導區轉錄為CRISPR序列，形成的一條長前體轉錄物被加工為成熟crRNAs。最后，crRNAs與Cas蛋白形成一種核糖核蛋白復合體(crRNP)，通過crRNA與前間隔序列之間的序列互補來識別入侵遺傳元件，通過DNA或RNA干擾來靶向破壞它們的核苷酸。

　　在這三種主要的CRISPR-Cas系統中，II型系統進行DNA干擾只需要一個稱作為Cas9的蛋白。Cas9具有多個結構域，在DNA干擾中與兩條小RNA：成熟crRNA和tracrRNA一起發揮作用。在獲得這一發現后不久，簡單的II型CRISPR系統便被利用于高等真核生物中在細胞和生物體水平上實現基因組編輯，在過去的幾年里CRISPR-Cas9技術在全球的應用呈爆炸性增長，當前已被廣泛用于許多不同的真核生物。此外，研究人員還在各種細菌中證實了CRISPR-Cas介導的細胞殺傷，并探討了利用遺傳工程I型和III型CRISPR-Cas系統或改變細菌宿主內源免疫系統來選擇性除去特異細菌物種。CRISPR-Cas系統還可用于促進生成基因組島刪除突變。但目前尚未有報道利用I型及III型系統來實現基因組編輯。

　　在這篇新文章中研究人員報告稱，開發出了一種利用I型和III型CRISPR進行基因組編輯的方法，實現了對冰島硫化葉菌的遺傳操控。這種方法是基于原核生物自身具有CRISPR系統。他們構建出了攜帶人工迷你CRISPR簇和包含非靶向序列供體DNA的一種新型基因組編輯質粒(pGE)。將pGE 質粒轉化到宿主細胞后，人工CRISPR簇提供的crRNA會與內源CRISPR系統提供的Cas蛋白形成核酸蛋白復合體crRNP，對靶標基因進行 DNA干涉。利用這一策略，研究人員生成了不同類型的突變，包括刪除、插入和點突變。

　　研究人員表示，這種方法可簡便適用于所有具有內源CRISPR-Cas系統的細菌和古細菌，同源重組的參與極大程度上避免了脫靶效應，增強了編輯特異性；更高的編輯效率，篩選陽性率高；流程簡單，操作周期短，大大減輕了原核生物基因組編輯的工作量。當前該方法已申請了新型發明ZL。