一、PCR 反應實驗程序1.準備 PCR 反應混合物：根據 DNA 樣本的數量來確定除了 DNA 外其他混合物的體積（額外增加一份來確保有足夠的 PCR 反應混合物），將擴增每一個遺傳標記并且在每一個 PCR 反應管內分 19.5uL 的反應混合物。 2.在每個管子中加 0.5, 的 DNA 樣本。 3.如果不用帶有加熱蓋的 PCR 儀，那么就需要在每個管子的頂部加入礦物油來防止液體蒸發。 4.把管子放在 PCR 儀中，95℃加熱 3 min 變性 DNA。 5.95℃ 變性 40s、55℃ 引物退火 40s、72℃ 延伸 40s，循環 30-35 次。 6.72℃ 終末延伸 7 min。 7.把 PCR 產物和尿素上樣緩沖液 1:1 混合. 二、將 PCR 產物行測序膠（6% 膠，21 cmX40 cmX0.4 mm)1.配制膠溶液：將 25 g 尿素、7.5 mL40% 丙烯酰胺：PDA(19:1)、IOmL5XTBE 加入到 250 mL 的錐形瓶中。加蒸餾水至 50 mL。充分混勻來溶解尿素 (見注釋 4)。 2..準備制膠板：把膠板洗干凈-確保上面沒有灰塵。用硅化玻璃板。根據各個廠家的不同把玻璃板夾在一起并且用膠條封住底部（這一過程根據設備的不同而有所變化)。 3.加入 500uL 10% 的過硫酸銨到膠混合液中并且通過濾紙過濾。 4.取出 10mL 膠溶液加入到一個小燒杯中并且加 10~15 斗 TEMED。馬上將膠倒到板上。幾分鐘之內膠將聚合到一起，封玻璃板的底部。 5.封好膠后，加 15ul 的 TEMED 到剩余的膠溶液中并且馬上把膠倒到兩塊膠板之間。仔細插入膠梳子，讓膠聚合 2 h 至過夜。 6.取下膠底部的封條。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確。將膠槽中灌滿 1XTBE.(大約 1.5L，根據裝置的不同量有所不同）。拔掉膠梳子，用 IXTBE 沖洗上樣孔。 7.把膠預熱 60 min 直到溫度在 50℃ 左右。 8.在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔。在每個孔中加 1?10/xL 的產物和上樣染料（上樣量根據梳子的大小和 PCR 產物的濃度而不同）。根據產物片段大小的不同跑膠時間可以從 30 min 到 3 h 之間變化。 三、銀染1.用一張 3 mm 厚的印跡紙把膠從測序膠裝置上取下。膠將粘到濾紙上直到把膠放在甲醇/冰乙酸溶液中才會游離。 2.切掉膠的底部，這樣它將適合放在耐熱烤盤中而不至于自己卷曲。在每個步驟中用足夠的溶液將膠浸沒（大約 300 mL)。在染膠過程中盡可能避免用手觸摸膠。把膠鋪平避免折疊，用戴手套的手輕觸膠的角。在每一步的過程中，把膠留在盤中，將舊洗液倒干凈（可以用一片塑料板或一張洗過的帶有小孔的 X 線片把膠輕輕地拿起來)。 3.在耐熱盤中倒入新鮮配制的 10% 甲醇/10% 冰乙酸，將膠浸泡 15 min，同時輕輕搖動耐熱盤使液體循環流動。 4.在 10% 的乙醇溶液中將膠沖洗 5 min。 5.把膠浸在 0.5% 的硝酸溶液中恰好 30s。 6.把膠用水充分沖洗 2 次。 7.把膠浸在 0.012mol/L 的硝酸銀溶液中 15~30 min。 8.快速充分的沖洗膠（用水把膠洗 2 次，任何洗不掉的硝酸銀都將產生沉淀，在膠上產生點狀沉積。膠不應該在水中浸泡時間過長因為銀離子也可以被洗掉)。 9.把膠浸在 300 mL 的顯色液中（當液體顏色變為棕色就應更換新液體)。 10.再用水沖洗一次。 11.把膠浸在 10% 的冰乙酸中至少 2 min 來終止反應。 12.用水沖洗膠。 13.用干膠器在兩塊玻璃紙之間干膠或者把膠放在 3 mm 的印跡紙上并且用包裝紙覆蓋頂部。 注釋1.DNA 通常是從 5~10mL 新鮮全血中提取獲得。我們通常選擇鹽析技術而不選擇酚。如果僅僅需要提取一定數量的樣品而不需要高質量的 DNA 用于其他目的，那么可以制備初級裂解產物。DNA 也可以從其他組織中提取，例如，從簡單的口腔沖洗液中提取的 DNA，其數量可以用于多個 PCR 反應 [24]。如果僅能得到很少量的 DNA，那么對這些 DNA 的預擴增將很有用。 2.引物可以通過定制合成（如果需要的量很大）。 3.在標準擴增條件下，2 h 內將完成 3 個循環的 DNA 合成。當為一些特殊的引物優化擴增條件時要考慮以下幾種因素： （1）沒有擴增或擴增很弱：試著降低幾度退火溫度，引物濃度加倍，逐步升高鎂離子濃度或者增加 3~5 個循環數。 （2）太多非特異擴增：試著降低循環數，調節鎂離子濃度，增加退火溫度 2~5℃，降低 Taq 酶的濃度。 （3）沒有產生引物二聚體擴增產物或者很弱：試著降低引物濃度，增加上面提到的不擴增時采用的步驟。 4.如果不用銀染，那么正常使用 bis(亞甲雙丙烯酰胺，iV，V-methylenebisacrylamide) 而不使用 PDA。PDA 是一種特殊的交聯劑，用來減少銀染背景的同時可以使膠更結實，這種交聯劑對于在銀染過程中用手移動膠是必需的。用 bis 的交聯劑能夠用于銀染，但是由于膠很脆，這種交聯劑僅能用于小膠。 展 | 