單克隆抗體制備技術

單克隆抗體制備標準化操作方案(McAb-sop)

第一章.小鼠免疫(BALB/c)

小鼠免疫是單抗制備的關鍵一環,質控小鼠免疫是制備優質單抗的唯一保證。

一.小鼠免疫分兩程方案:根據免疫學原理小鼠免疫方案設計如下:

1.短程免疫方案:

第一次:   1d   100ug(可溶性Ag)+等體積完全佐劑.   腹腔注射. 0.4ml/只

第二次:   7d   100ug+等體積不完全佐劑           腹腔注射. 0.4ml/只

第三次:   12d   50ug                                 IV   0.3ml/只

(強化)第四次: 15d   20ug                                 IV   0.3ml/只

第17 d~24d內融合

2長程免疫方案:

第一次:   1d    100ug+等體積完全佐劑           腹腔注射(IP)0.4ml/只

第二次:  14d    100ug+等體積不完全佐劑           IP      0.4ml/只

第三次:  21d    100ug                            IP或IV 0.4ml/只                      

第四次:  25d     50ug                              IV    0.3ml/只

(強化)第五次: 28d    20ug                              IV    0.3ml/只

第30d~37d內融合.

注意:a.在融合前(即加強免疫前)必須測定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必須≥1:8000,長程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周內做完融合. 否則不能保證融合質量。                                                                             二． 小鼠免疫質控標準

1．免疫鼠血清滴度   短程≥1：8000，長程≥1：32000；                   

2．小鼠免疫后需在一周內做完融合；

3．免疫鼠脾臟明顯大于空白鼠脾臟并且較粘連。

免疫鼠選擇：免疫種類為:baleb/c小鼠；性別.雌性佳：大小：6-7周齡：體重：20g;

健壯.活潑。

第二章．細胞融合

一． 融合前準備

1．  脾細胞：取符合免疫質控標準的鼠在無菌條件下取出其脾臟，并制成單個脾細胞懸液，每只鼠的脾細胞約1～3億。在制備過程中嚴格保證無菌。制備脾細胞可選擇研磨器+篩網或用無菌注射器吹吸。

2．  SP2/0細胞準備：SP2/0細胞在融合前4天腹蘇.并用8- Ag篩選兩次，隔天換液，在融合前一天換成普通培養基1640,10%小牛血清，SP2/0細胞數量在2000萬～3500萬為宜，細胞處于分裂期較佳，衰老細胞不宜使用。

3．  PEG1450準備：取PEG1450干粉高壓后加入等體積 PBS在60℃溶解即可使用，一次融合取0.8ml 50% PEG1450.

4．  HAT培養基準備：根據鋪板數量準備，20%小牛血清的HAT1640培養基.20ml/塊板。

5．  終止液15-20ml:不含 Hepes的1640培養基或PBS（PH7.4）

二. 融合:

制備脾細胞懸液并用PBS(PH9.4)洗滌干凈后混入SP2/0細胞按脾細胞比SP2/0=10:1～5:2混合并離心,1200rpm×５min 離心后滴干混合細胞.輕敲彈松細胞團塊。在37℃水浴中加入PEG1450  0.8ml在50秒內加完　不宜吹打，加完后在37℃水浴中反應2min后加入終止液在 5min內加完15～20ml,加終止液時應沿管壁緩慢加入.動作應輕柔.不宜吹打以免使剛融合的細胞分離。

三. 融合后加樣:

融合細胞終止后于900rpm×8min離心，并吸干以防殘留PEG。離心后把融合細胞轉入HAT培養基，并滴板200ul/孔，全過程應防止吹散融合細胞。

四. 換液:

待融合細胞在HAT中培養7天左右后（即未融合的SP2/0和脾細胞死后）換成HT培養基。200ul/孔 第8～10天檢測。

第三章．細胞建株

一.融合板檢測：

待融合板換液細胞長至中等大小約1萬個細胞以上開始檢測（檢測方法參見附表ELISA方法）在ELISA質控合格（即陰性對照<1.0，陽性對照>1.0）后挑選陽性孔（一般OD450≥0.5）作亞克隆。

二.亞克隆方法及檢測:

挑出融合板陽性孔全部細胞加入8-10ml HT培養基，混均鋪板4-6縱行；待亞克隆生長5-7天，克隆長大（約1萬個細胞以上/孔），即可檢測（用 ELISA方法）。

三.單克隆鋪板和檢測:

挑取亞克隆檢測陽性值高的孔計數作有限稀釋4:2:1:0.5個細胞四個梯度鋪板1個陽性細胞株/塊。待單克隆生長7-10天，單克隆細胞長至中等大小（1萬/孔）時進行檢測，其中單克隆細胞≥8個/株（一般檢測12個孔），待檢測單克隆全陽后再進行一次同樣的單克隆。

四．細胞株確立：

待兩次單克隆檢測全陽后挑出三孔/株，作擴大培養于24孔板；24孔板細胞長滿后作交叉Ag鑒定和穩定性鑒定（即再次測其培養上清看是否還能分泌單抗）鑒定合格后選擇其中一株長勢好.OD450箱高的擴大培養于細胞瓶，并進行凍存，5支/株，≥200萬/支細胞。

第四章．細胞株鑒定

在細胞株凍存完畢后必須復蘇同一批次中的一支進行鑒定。

鑒定標準：

1.復蘇活細胞數≥100萬個細胞/支；

2.活細胞中有活力細胞≥50萬/株;

3.復蘇細胞中不能有除細胞株細胞以外的其它微生物(如:細           菌.真菌.支原體等)出現.

4.復蘇細胞生長到一定數目后選出生長好的細胞作單克隆計 數鋪板.并檢測單克隆的分泌抗體能力是否是否全陽或有抗體分泌.

5.細胞培養上清也需作ELISA確定是否分泌抗體同時作交叉抗原復查,及 western-boltting鑒定是否為單抗。    

第五章．腹水制備及細胞株擴增

腹水制備：在細胞株鑒定合格后收集培養瓶中細胞，打小鼠腹水方法如下：

1. 小鼠選擇：10周齡  baleb/c雌性小鼠，小鼠毛發油光，活潑約30克體重。

2. 打腹水前小鼠準備：選優鼠在打腹水前，7—30天內致敏小鼠選石蠟油（或其它礦物油）0.5ml/只IP(腹腔)注射。

3. 打腹水：收集合格雜交瘤細胞加于PBS（PH值7.4）或生理鹽水(無菌)中,200萬-500萬/只鼠。IP

4. 腹水收集：雜交瘤細胞注入小鼠腹腔后5-7天即可產生腹水。（小鼠狀態：腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思飲）此時可用無菌注射器抽取約2-5ml/只。腹水特點：血性或乳白色或微黃、脂性、略濃。一般隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次即可處死。）

腹水保存：抽取腹水后置4℃過夜。離心500rpm×10min.取上清短期存放于4℃(3-7天)，中期1-2月放于-20℃，長期6月者存放于-80℃。