單克隆抗體的制備過程

單克隆抗體在現代生物醫學中的作用越來越大，它不僅被廣泛應用于生化和免疫檢測，而且治療癌癥和自體免疫疾病的單抗藥物也逐漸批準上市。因此單抗的制備和篩選具有其內在的重要性。

動物免疫

取4只6周齡雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原（20 μg/只），第一次免疫與等量弗氏完全佐劑乳化，0.2 mL/只；兩周后進行第二次免疫，抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射，0.2 mL/只；兩周后進行第三次免疫，免疫方法及劑量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠眼眶采血測其效價，第三次免疫兩周后，選擇效價最高的小鼠，用不加佐劑的抗原加強免疫，3 d后取小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合。

細胞融合

1 骨髓瘤細胞的準備

選擇生長狀態良好的SP2/0細胞，覆蓋瓶底80％時棄上清，以不完全培養基洗滌一次后，用l0 mL不完全培養基將細胞輕輕吹下。

2 脾淋巴細胞的準備

取加強免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫臼將小鼠致死，用75%酒精消毒體表10 min，隨即放入超凈臺內的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；無菌打開腹腔取出脾臟，用基礎培養基洗滌，并仔細去掉周圍附著的結締組織；隨后將脾臟轉移到另一個盛有DMEM的平皿中。用研磨棒擠壓，使脾細胞充分釋放，制成脾細胞懸液。

3 飼養細胞的制備

取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作為陰性血清，頸脫臼處死；體表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0 mL注射器，12#針頭，吸取10 mL HAT培養基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部，抽回腹腔內液體，注入己準備好的容器中。

4 融合

將上述制備的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于一支50 mL的帶蓋的融合管中，1000 rpm離心10 min，棄上清。將融合管置于手掌中，輕輕摩擦底部，使兩種細胞充分混勻；在37°C水浴中45 s內緩慢加入1 mL預熱的PEG-1500到融合管中，邊加邊輕輕搖勻；隨即在90 s內先慢后快滴加30 mL 37°C預熱的不完全DMEM培養基，使PEG稀釋而失去作用，37°C靜置10 min，1000 rpm離心10 min；棄上清，用60 mL HAT培養基輕輕懸浮沉淀細胞，再加入適量的腹腔巨噬細胞。

分裝于96孔細胞培養板，然后將培養板置37°C 6% CO2培養箱內培養；5 d后用新鮮的HAT培養基換出一半培養基；10 d后用預熱的HT換出HAT；觀察雜交瘤細胞的生長情況，待其細胞培養上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取適量細胞上清進行ELISA檢測,兩次檢測結果為陽性設為陽性克隆孔。

雜交瘤細胞的克隆化及建株

采用有限稀釋法對連續兩次檢測為陽性的細胞株進行克隆化。陽性細胞計數，取100個細胞放入5 mL含飼養細胞的培養液中，即20個細胞/mL，100 μL/孔滴加于96孔細胞培養板，即每孔1個細胞：再將余下的細胞懸液倍比稀釋，細胞數為10 個/mL，100 μL /孔滴加于96孔細胞培養板，即每孔0.5個細胞。

第8～9 d時，肉眼可見細胞克隆，對出現單個細胞克隆的孔再按篩選陽性雜交瘤細胞的間接ELISA方法進行篩選。連續進行三次以上亞克隆，判為陽性的細胞株擴大培養，建株凍存。