單分子技術解析促凋亡蛋白tBid引發膜通透的動力學過程

　　10月9日，國際學術期刊Nano Letters 發表了中國科學院生物物理研究所衛濤濤課題組與中國科學院物理研究所李明課題組題為Detection of tBid Oligomerization and Membrane Permeabilization by Graphene-Based Single-Molecule Surface-Induced Fluorescence Attenuation 的合作研究論文。文中通過應用新的單分子研究技術——基于納米材料氧化型石墨烯表面誘導熒光衰逝的單分子熒光技術（single-molecule surface-induced fluorescence attenuation，smSIFA），解析了Bcl-2家族蛋白tBid與模型膜的相互作用，并揭示了tBid在膜表面通過同源寡聚化形成類孔道結構的動力學過程。

　　細胞凋亡是一種由多基因調控、在進化上保守的程序性死亡過程，是維持多細胞生物體穩態并清除多余或有害細胞的重要生命過程。在細胞凋亡的內源/線粒體途徑中，Bcl-2家族蛋白通過家族之間以及蛋白-膜脂之間的相互作用發揮重要的調控作用，其中對細胞器膜（例如線粒體膜、溶酶體膜等）的通透作用（permeabilization）是調控細胞凋亡過程的關鍵步驟。促凋亡蛋白Bid參與調控線粒體膜和溶酶體膜的完整性，是聯結細胞凋亡的外源和內源途徑的橋梁分子。Bid被胱天蛋白酶-8（caspase 8）剪切激活后，tBid（truncated Bid）既可以作為凋亡催化者激活Bax或Bak從而引起線粒體外膜通透，又可以作為凋亡執行者直接誘導線粒體膜或者溶酶體膜的通透。楊福愉/衛濤濤課題組前期的研究結果表明tBid可以與溶酶體膜相互作用并引起膜通透，并進一步證實溶酶體膜上的磷脂酸（phosphatidic acid，PA）是與tBid相互作用的重要分子（Cellular and Molecular Life Sciences 2010；Journal of Lipid Research 2012），然而tBid與生物膜相互作用的動力學過程和蛋白質變構的分子機制仍不明晰。

　　隨著技術的發展，單分子熒光技術漸漸成為研究蛋白質與膜脂相互作用的有力武器。相比于測量分子集體信號的方法，單分子熒光技術可以探測單個分子的運動和特點，提供了整體水平無法觀測到的生物分子的復雜性。雖然一些單分子熒光技術，如單分子熒光共振能量轉移（single-molecule fluorescence resonance energy transfer，smFRET）技術在研究蛋白與膜脂的相互作用中發揮了作用，但其無法反映出蛋白在膜內縱向運動的精確信息。近期，李明課題組研發出一種新的縱向亞納米分辨率的單分子熒光技術——單分子表面誘導熒光衰逝技術（smSIFA）。當熒光分子靠近氧化型石墨烯介質膜表面時，熒光淬滅的效應會隨著距離的變化而發生顯著的變化。這使得在通過單分子定位技術獲得單個蛋白分子在平行于膜表面運動的同時，還能獲得垂直于膜表面的運動軌跡。

　　衛濤濤課題組與李明課題組應用smSIFA技術進行了合作研究，分析了不同位點單標記的tBid在與膜脂作用并誘導膜通透的過程中蛋白的縱向和橫向動力學過程。在tBid單體與類溶酶體膜結合時，蛋白整體處于脂雙層膜表面的位置，并開始形成同源寡聚體；在寡聚體形成的起始階段，tBid兩個核心的疏水螺旋（α6和α7）插入膜內較淺的位置，而其他螺旋依然在膜表面的位置；在低聚的tBid團簇中，α6和α7在膜內深淺的位置發生動態變化，其他螺旋可能變構到膜的深層位置，導致形成瞬時的二維孔道結構，引起膜通透，進而誘導細胞凋亡。上述smSIFA實驗結果也被分子動力學模擬所驗證。文中應用smSIFA技術在單分子水平以亞納米精度分析了tBid與脂質雙層之間相互作用的動力學過程，加深了對tBid在溶酶體膜上形成孔道并誘導細胞凋亡的認識和理解。

　　李明課題組的馬麗、胡書新和衛濤濤課題組的賀小龍為論文的共同第一作者，衛濤濤和李明為論文的共同通訊作者。該研究得到國家自然科學基金、中科院基金、王寬誠教育基金、國家重點研發計劃的資助。

圖：smSIFA技術原理和tBid蛋白單體在磷脂膜上的構象變化