單層細胞傳代培養時常出現的問題

1. 細胞難脫離

? 培養基內含有某些抑制成分（例如血清）使細胞解離液失活。

解決對策：在加入細胞解離液（dissociating solution）之前，先用DPBS潤洗細胞兩次或者是直接用細胞解離液潤洗細胞。

? 選用的細胞解離液太弱。

解決對策：提高酶濃度、EDTA濃度，或者使用作用更強的細胞解離液（如dispase, collagenase），或者是把細胞置于37°C孵育以提高解離液的活性。

? 細胞達到100%匯合時間太久，細胞間連接變得非常牢固，阻礙了解離液滲透到細胞與培養基質接觸的界面。

解決對策：當細胞達到大約70%-90%匯合時，即進行傳代。

2. 細胞脫離下來后聚集成團（Clumps）

? 分離過程太劇烈，導致細胞裂解釋放基因組DNA。原因有二：一，移液槍吹打太劇烈；第二，選用的細胞解離液太強或有毒性，導致pH或滲透壓異常。

解決對策：往細胞懸液內加入一滴無菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA鏈斷裂。在隨后的操作中，注意溫和吹打細胞懸液，縮短孵育時間，換用弱一點的細胞解離液或者在低一點的溫度下孵育。

? 如果收集的單細胞懸液沒有立即加入培養基稀釋并接種到新的培養皿內繼續培養，而是在室溫放置一段時間。這種情況下，細胞也有可能會聚集成團。

解決對策：將細胞懸液放置在冰上。

? 細胞懸液離心去除多余解離液時，離心太劇烈或時間過久。

解決對策：確保溫和離心，推薦使用125g離心10 min。

3. 細胞重新貼壁困難

? 細胞解離過程持續時間過長，使得存在于細胞膜上的細胞附著所必需的蛋白剝離。

? 培養基內缺少足夠的血清或黏附因子（常見于無血清培養基）。

解決對策：往培養基內添加黏附因子或者選用蛋白（collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.）包被過的培養容器。

? 未失活細胞解離液或者離心去除細胞解離液。

解決對策：在培養基內添加額外的血清或特異性酶抑制劑（例如，大豆胰蛋白酶抑制劑）中和細胞解離液。亦或使用125g離心5min去除細胞解離液，然后使用新鮮培養基重懸細胞。

4. 細胞活力低

? 細胞分離過程太劇烈

解決對策：自行摸索解離時間。

? 配制細胞分離液所用的平衡鹽溶液（Balanced Salt Solution）pH或滲透壓異常。

解決對策：測量pH或滲透壓或直接換一瓶新的平衡鹽溶液。

? 在重新接種之前，單細胞懸液以非常高的細胞密度在室溫放置時間過長。

解決對策：將細胞懸液置于冰上。

? 培養基選擇不恰當。

解決對策：推薦使用與原代細胞相配套的專屬培養基。