單層細胞的胰蛋白酶處理

1) 吸干培養單層細胞的細胞培養瓶或培養皿中的培養液。

2) 加入 0.05% 胰蛋白酶工作液（T-25 細胞培養瓶加入 1 ml；T-75 細胞培養瓶加入 3 ml)。

無菌的 10x 或 1x 胰蛋白酶/EDTA 工作液可從 Life Technologies 購買或按照下列配方配制：

胰蛋白酶 1x 工作液（0.05%)

胰蛋白酶/EDTA 10x 儲存液       100 ml
NaCl                   7.1g
KCl                      0.4 g
葡萄糖                1.0 g
NaHCO₃            0.35 g
1% 酚紅             1.0ml
H₂O                    900 ml

調節 pH 至 7.2
小心：KCl, 酚紅

胰蛋白酶/EDTA 10X 儲存液
胰蛋白酶（1:250)          5.0 g
EDTA?四鈉鹽                  2.0 g
NaCl                                0.85 g
H₂O                                 100 ml

-20°C 儲存胰蛋白酶/EDTA10x 儲存液和 1x 工作液。小量分裝物可置 4°C 保存 1~2周。胰蛋白酶放置于 37°C 的時間應盡可能縮短以免胰蛋白酶降解、酶活性下降，

3) 快速地前后旋轉細胞培養瓶 4~5 次以便胰蛋白酶包被所有瓶內細胞，并且痕量的培養液及血清得到稀釋。

4) 檢查細胞，不要待細胞脫落后才吸除胰蛋白酶工作液。

5) 另加 1~3 ml 胰蛋白酶工作液，再旋轉細胞培養瓶 4-5 次。

6) 注意在細胞尚未脫落前吸除胰蛋內酶工作液。

7) 將細胞培養瓶蓋松松擰上后置細胞培養瓶于 37°C 培養箱中 2~5 分鐘。

8) 用手輕拍細胞培養瓶使得瓶內的少量液體能夠帶下已經要脫壁的細胞，檢查細胞脫落情況。苦無細胞脫落將細胞培養瓶再放冋 37°C 培養箱中孵育數分鐘。繼續輕拍細胞培養瓶直至細胞完全脫落。

9) 再懸細胞于細胞培養液內（2~5 ml/T-25 細胞培養瓶)。

10) 輕輕吹打細胞使得團狀細胞分散，以需要的細胞密度接種細胞。

注意事項

? 如果采用含有 EDTA 螯合劑的溶液作為預洗液，該傳代方案中胰蛋白酶的用量可減少。在此種情況下，步驟 2 可作修改，因為采用不含胰蛋白酶的預洗液。

預洗液

EDTA. 四鈉鹽               2.0 g
NaCl                             8.0 g
KCl                                0.4 g
葡萄糖                          1.0g
NaHCO₃                      0.35 g
1% 酚紅                       1 ml
H₂O                              900 ml

調節 pH 至 7.2

? 對于對胰蛋白酶不很敏感的細胞系，下面的快速胰蛋白酶處理方案可供選擇

a. 用 PBS 洗滌單層細胞。

b. 加人足夠量的 lx 胰蛋白酶工作液以覆蓋所有細胞，37°C 孵育 5 分鐘。

c. 檢查細胞脫落情況，吸取胰蛋白酶工作液屮的細胞，用培養液稀釋至欲接種的細胞數。