單堿基基因編輯研究進展速覽

　　本文中，小編整理了近年來科學家們在單堿基基因編輯研究領域取得的新進展，分享給大家！

　　【1】Nat Commun：科學家首次在豬身上實現多位點單堿基編輯

　　doi：10.1038/s41467-019-10421-8

　　近日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學課題組利用單堿基編輯器首次在豬上實現多位點單堿基編輯。據悉，該成果的應用將加速生物醫藥相關的大動物豬模型培育和農業精準育種。相關研究6月28日發表在Nature Communications雜志上。

　　賴良學表示，該研究首次從細胞、胚胎及動物三個層面探討了單堿基編輯器對豬多基因進行同時點突變的可行性，并且通過體細胞核移植和胚胎注射兩種途徑獲得兩種單位點單堿基突變豬模型（杜氏肌營養不良癥和早衰癥豬模型）和一種三位點單堿基突變豬模型（重癥免疫缺陷豬模型）。

　　單堿基編輯器是近年才出現的新基因編輯系統，被認為是基因編輯技術3.0版本。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會伴隨DNA斷裂，后者會造成基因組的不穩定性，對被編輯的生物機體帶來安全隱患。

　　【2】Nature：科學家首獲三種更高精度單堿基編輯工具

　　doi：10.1038/s41586-019-1314-0

　　中科院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）楊輝研究組、四川大學郭帆研究組和中科院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所李亦學研究組合作，通過全轉錄組RNA測序首次發現，包括BE3、BE3-hA3A和ABE7.10等在內的DNA編輯工具單堿基編輯技術存在大量的RNA脫靶，并且ABE7.10還會導致大量的癌基因和抑癌基因突變，具有較強的致癌風險。研究人員通過點突變的方式對3種單堿基編輯工具進行突變優化，使其完全消除RNA脫靶的活性，首次獲得3種更高精度的單堿基編輯工具，為單堿基編輯技術進入臨床治療提供了重要的基礎。6月11日，相關成果在線發表于Nature雜志。單堿基編輯是一種高精度基因編輯技術，因其能實現高精度的目標打靶，因而成為罕見病基因治療的熱門工具之一，對于基因突變導致的遺傳疾病的治療具有重大意義。

　　2019年3月，楊輝團隊在《科學》上報道了單堿基編輯技術BE3存在全基因組范圍內的脫靶，引起廣泛關注。此前的研究對于基因編輯工具的脫靶檢測都瞄準在DNA水平，此次楊輝團隊將DNA編輯工具脫靶的檢測范圍擴展到RNA水平，首次證明常用的3種單堿基編輯技術均存在大量的RNA脫靶。通過精巧的實驗設計，研究人員證明RNA脫靶主要是由于融合在Cas9上的脫氨酶導致；同時發現被寄予厚望的ABE7.10存在大量的RNA脫靶，并高頻率地發生在癌基因和抑癌基因上。

　　【3】Science：中國科學家發現胞嘧啶單堿基編輯器存在全基因組范圍的脫靶效應

　　doi：10.1126/science.aaw7166

　　人類的遺傳疾病與農作物農藝性狀改變通常是由基因組中的單個或少數核苷酸的突變引起的。單堿基基因編輯技術為定向編輯基因組中的關鍵核苷酸變異提供了重要工具。中科院遺傳與發育生物學研究所研究員高彩霞團隊在水稻中對兩種胞嘧啶編輯器(CBE) BE3和HF1-BE3， 以及一種腺嘌呤編輯器(ABE)的特異性進行了全基因組水平評估，首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。相關研究成果于3月1日在線發表在Science雜志上。

　　鑒定與定向修正基因組中關鍵的核苷酸變異，是人類遺傳疾病治療及動植物育種的重要研究方向。基于CRISPR系統的單堿基基因編輯技術是近年來取得的革命性技術之一，已廣泛應用于基礎研究、疾病治療和作物遺傳改良等各個方面。根據靶向堿基的不同，單堿基編輯器主要分為兩類，胞嘧啶單堿基編輯器與腺嘌呤單堿基編輯器，分別由胞嘧啶脫氨酶或改造的腺嘌呤脫氨酶與nCas9蛋白融合而來，對應地可在基因組中的靶向位點實現C>T或A>G的堿基編輯。

　　【4】Cell Res：劉光慧等通過單堿基基因編輯重塑超級干細胞

　　doi：10.1038/cr.2017.86

　　從提高農作物的抗病能力，到原位編輯動物遺傳密碼，再到靶向摧毀發生基因突變的線粒體，乃至特異性矯正病人細胞中的致病基因突變，基因編輯技術的迅猛發展正在為人類的健康和生活帶來不同層面的改變。日前，中科院生物物理所劉光慧課題組、北京大學湯富酬課題組和中科院動物所曲靜課題組聯合開展的研究進一步拓展了基因編輯技術的應用范圍。研究人員利用基因編輯改寫了人類基因組遺傳密碼中的單個堿基，首次在實驗室中獲得了遺傳增強的“超級”干細胞。這種GES細胞能夠對細胞衰老和致瘤性轉化產生雙重抵抗作用，因此為開展安全有效的干細胞治療提供了可能的解決途徑，相關研究刊登在國際雜志Cell Research上。

　　再生醫學領域存在兩個亟待解決的重要科學問題：（1）干細胞治療的有效性，即如何獲得更多高質量的可供移植治療的人類干細胞，如何賦予這些細胞移植物更強的自我更新、存活、定向分化以及對移植環境（如衰老與應激）的耐受能力，以便令其在體內發揮更為持久的治療效果。（2）干細胞治療的安全性，即如何有效降低細胞移植物在體內形成腫瘤的風險。最新發表的這項研究工作聚焦于上述兩個重要問題，期望通過基因編輯手段對細胞內的關鍵基因和信號通路進行精確調控，從而同時實現干細胞活力的提高及致瘤性的減弱，最終獲得優質安全的人類干細胞移植物。

　　【5】Nat Methods：新方法對人類基因組進行有效地單堿基編輯

　　doi：10.1038/nmeth.2840

　　近日，來自格萊斯頓研究院的研究團隊開發了一項新技術，可以對人類基因組進行單堿基編輯。這不僅增強了目前在干細胞中模擬疾病的能力，也為基因治療新途徑提供了基礎。相關研究論文發表在Nature Methods雜志上，其中提出如何有效并且精確地捕獲罕見致病突變，以及如何修正這些突變。

　　“隨著人類遺傳學的進步，人們發現了數以百計的與疾病相關的基因突變，但目前我們仍缺乏研究它們的有效方法。”格萊斯頓的醫學博士Bruce解釋道，“我們需要一種強力有效并且精確的方法來實現對人類基因組的單堿基編輯，而我們的新技術正是這樣的一種方法。”阻礙科學家們研究遺傳學疾病的主要挑戰在于，致病突變出現的頻率可低至1%，這使得尋找、研究它們變得非常困難。

　　【6】Science子刊：一種新型腺嘌呤堿基編輯器可讓細胞RNA編輯最小化

　　doi：10.1126/sciadv.aax5717

　　在一項新的研究中，來自美國布羅德研究所和哈佛大學的研究人員發現有證據表明使用堿基編輯器會導致細胞中出現意想不到的RNA編輯，相關研究結果發表在Science Advances期刊上，在這篇論文中，他們描述了他們對CRISPR類型腺嘌呤堿基編輯器（ABE）的研究。

　　ABE將一個DNA堿基對轉換成另一個DNA堿基對，從而允許修復某些細胞類型中的突變，而不會產生不想要的編輯效應。據認為，ABE還有潛力校正幾乎一半已知的導致醫學疾病的遺傳異常。ABE的科學基礎對醫學界來說變得越來越重要。不幸的是，最近的一些研究已發現，ABE可能也會導致意料之外的編輯。在今年3月，一個研究團隊發現胞嘧啶堿基編輯器3型（CBE3）以高于正常的速率誘導單核苷酸變異。在上個月，另一個研究團隊發現胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和ABE導致RNA中的脫靶編輯。在這項新的研究中，這些研究人員試圖在使用ABE時進一步測試脫靶編輯，并在確認后找到一種解決方案。

　　【7】Science：我國李亦學課題組和楊輝課題組揭示胞嘧啶堿基編輯器誘導大量的單位點脫靶突變

　　doi：10.1126/science.aav9973

　　基因組編輯在治療由致命性突變引起的遺傳疾病上有很大的潛力。對基因組編輯的脫靶效應進行全面分析是驗證這種編輯實用性所必需的。科學家們已開發出多種方法來檢測全基因組范圍內的基因編輯脫靶位點。然而，這些方法并不適用于檢測體內的單核苷酸變異（SNV）。

　　在一項新的研究中，中國科學院等機構的研究人員開發出一種稱為GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection， 利用雙細胞胚胎注射進行全基因組脫靶分析）的方法來評估三種經常使用的基因編輯工具---CRISPR/Cas9、胞嘧啶堿基編輯器3（BE3， rAPOBEC1-nCas9-UGI）、腺嘌呤堿基編輯器7.10（ABE7.10， TadA-TadA*-nCas9）---誘導的脫靶效應。簡言之，這些研究人員將CRISPR/Cas9、BE3或ABE7.10與Cre mRNA一起注射到源自Ai9（CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato）小鼠的雙細胞胚胎的卵裂球中。在胚胎期第14.5天（ED14.5）時，基于tdTomato的表達，利用熒光活化細胞分選方法（FACS）對經過編輯的卵裂球和未經過編輯的卵裂球的后代細胞進行分選。與此同時，在ED14.5時，整個胚胎也很容易經消化后獲得足夠的單細胞。他們隨后對tdTomato陽性細胞和tdTomato陰性細胞單獨地進行全基因組測序（WGS）。以來自相同胚胎的tdTomato陰性樣本作為對照，利用三種算法對來自相同胚胎的tdTomato陽性樣本中的SNV和indel（insertion or deletion， 插入或刪除）進行研究。

　　【8】Protein Cell報道我國科學家進一步優化腺嘌呤堿基編輯系統

　　doi：10.1007/s13238-018-0568-x doi：10.1007/s13238-018-0566-z

　　在兩項新的研究中，來自中國華東師范大學和中山大學的兩個研究小組在小鼠和大鼠品系中開發出一種被稱作腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor， ABE）的堿基編輯系統，并對這種系統加以改進，這將對人類遺傳疾病和基因療法帶來重大的影響，相關研究結果發表在Protein & Cell期刊上。人基因由堿基A、T、C和G組成，這些堿基以特定的順序排列在一起來編碼遺傳信息。這種ABE系統能夠產生所需的A→G轉化，因而允許科學家們改變遺傳密碼，同時讓不想要的結果最小化。鑒于幾乎一半的人類遺傳疾病是由C/G→T/C突變引起的，這最好是通過ABE系統加以校正，因此它是一種有前景的治療應用技術。

　　小鼠和大鼠是生物學和醫學研究中最為重要的兩種模式生物，這是因為它們很容易繁殖并且在生理上與人類相似。利用經過基因修飾的嚙齒類動物模型，科學家們在理解人類生物學、疾病病理學和開發治療多種疾病的治療方法方面取得了重大進展。然而，即使使用像CRISPR/Cas9這樣的靶向基因組編輯技術，也不容易培育出含有在人類疾病中鑒定處的點突變的小鼠或大鼠品系。

　　【9】Science：中科院高彩霞課題組發現胞嘧啶堿基編輯器引發意想不到的全基因組脫靶突變

　　doi：10.1126/science.aaw7166

　　在一項新的研究中，中國科學院的高彩霞（Caixia Gao）課題組通過對作為一種重要的作物物種的水稻進行全基因組測序對胞嘧啶堿基編輯器（BE3和HF1-BE3）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）產生的脫靶突變進行全面調查。他們發現胞嘧啶堿基編輯器（BE3和HF1-BE3）誘導全基因組脫靶突變，相關研究結果發表在Science期刊上。

　　單核苷酸變化是人類疾病和經濟生物中性狀變異的重要原因。通過堿基編輯器對單核苷酸多態性進行基因改造為基因療法帶來了巨大希望，這可能潛在地治愈人類疾病并改善作物植物的性狀。科學家們已開發出胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）。這些堿基編輯器是將切口酶型Cas9蛋白與胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶融合在一起形成的，并且經發現它們在單向導RNA（sgRNA）的靶位點中促進C>T或A>G轉化（即在靶轉化）。盡管CBE和ABE的在靶轉化（on-target conversion）在許多有機體中發現，但是它們的脫靶效應并未在全基因組水平上進行過系統性評估。