• <table id="4yyaw"><kbd id="4yyaw"></kbd></table>
  • <td id="4yyaw"></td>
  • 發布時間:2020-09-08 11:01 原文鏈接: 單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)

    單細胞凝膠電泳分析(single cell gel eletrophoresis,SCGE)是由Ostling等(1984)首創,后經Singh等(1988)進一步完善并逐漸發展起來的一種快速檢測單細胞 DNA損傷的實驗方法,適用于多種細胞,能夠靈敏地檢測DNA斷裂,在檢測誘變劑、射線等對DNA的損傷、監測環境污染物對機體的遺傳損害、研究毒物致癌機制等方面有廣泛的應用價值。因其細胞電泳形態頗似彗星,又稱彗星實驗(comet assay)。
    有核細胞的DNA分子量很大,DNA超螺旋結構附著在核基質中,用瓊脂糖凝膠將細胞包埋在載波片上,在細胞裂解液作用下,細胞膜、核膜及其它生物膜遭到破壞,使細胞內的RNA、蛋白質及其它成分進入凝膠,繼而擴散到裂解液中,但核DNA仍保持纏繞的環區附著在剩余的核骨架上,并留在原位。如果細胞未受損傷,電泳時,核DNA因其分子量大停留在核基質中,熒光染色后呈現圓形的熒光團,無脫尾現象。若細胞受損,在中性電泳液(pH=8)中,核DNA 仍保持雙螺旋結構,雖偶有單鏈斷裂,但并不影響DNA雙螺旋大分子的連續性。只有當DNA雙鏈斷裂時,其斷片進入凝膠中,電泳時斷片向陽極遷移,形成熒光拖尾現象,形似彗星。如果在堿性電泳液(pH>13)中,先是DNA雙鏈解螺旋且堿變性為單鏈,單鏈斷裂的碎片分子量小可進入凝膠中,電泳時斷鏈或碎片離開核DNA向陽性遷移,形成拖尾。細胞DNA受損愈重,產生的斷鏈或堿易變性斷片就愈多,其斷鏈或斷片也就愈小,在電場作用下遷移的DNA量多,遷移的距離長,表現為尾長增加和尾部熒光強度增強,因此,通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度可定量地測定單個細胞DNA損傷的程度。SCGE檢測單細胞水平DNA損傷,無須放射性示蹤,適用于各種有核細胞,樣品用量少,試驗周期短,故而靈敏、快速、高效。
    單細胞凝膠電泳基本過程 最常用的是堿性SCGE方法。
    制片:首先制備細胞懸液,然后制片。制片有3種類型:①"三明治"凝膠:是在磨毛玻璃上鋪第一層5%的正常熔點瓊脂糖,第二層為細胞懸液與0.5%低熔點瓊脂糖混合液(10/1),第三層為0.5%低熔點瓊脂糖;②雙層凝膠:不鋪上述第三層凝膠;③單層凝膠:為改善其易與玻片分離的缺點,在玻片上制一凹槽進行單層灌膠。常用"三明治"凝膠
    細胞裂解
    (堿性SCGE)移去膠板上的蓋玻片,將膠板浸入新配置的預冷4℃裂解液(2.5M NaCL、100mN Na2EDTA、10mN Tris-HCL PH 10、1%肌氨酸鈉、用前加1%Triton和1%DMSO)中至少1h。
    (中性SCGE)將膠板小心地浸入裂解液中(30mMEDTA、0.5%SDS、PH8.3)然后放入孵育箱中50℃4h。起始實驗使用含 0.5mg/ml蛋白激酶K的裂解液。如果裂解的時間4h或更長在50℃蛋白激酶K對于實驗敏感性是不會產生影響的。溶解后,將玻片充分清洗(250ml /10張片,洗3次)在90mMTris-90mM硼酸-2mMEDTA緩沖液。在沖洗后4~16h。
    電泳:在堿性SCGE實驗中,電泳前先將玻片浸沒于堿性電泳緩沖液中,使DNA解螺旋,然后進行電泳。
    中和、染色:用Tris緩沖液中和凝膠后,用染色劑染色。常用的染色劑有吖啶橙、溴化乙啶、PI(碘化丙啶)、YOYO-1苯并噁唑啉)等。染色后盡快檢測,時間過長熒光將褪色。為了減少額外的DNA損傷與修復,應在暗淡的間接光(黃或紅色)照明下進行。
    圖象分析:在熒光顯微鏡下,觀察單細胞電泳圖象(放大200倍或400倍)。
    細胞凋亡的研究
    凋亡細胞的DNA降解以雙鏈斷裂為特征,因此中性、堿性SCGE均可用于檢測凋亡細胞。凋亡
    過程中有內源性核酸內切酶參與,將DNA分子裂解產生180~200 或其整體倍數大小的DNA片段,在SCGE實驗中呈現獨特的小頭大尾的形態學特征。

  • <table id="4yyaw"><kbd id="4yyaw"></kbd></table>
  • <td id="4yyaw"></td>
  • 调性视频