單細胞激光拉曼光譜檢測重組大腸桿菌細胞表達甲酸脫氫酶
摘要甲酸脫氫酶( FDH，EC1． 2． 1． 2) 在工業生產中有重要的應用價值，工業上應用的FDH 可以通過構建高水平表達重組FDH 蛋白的基因工程菌生產，用分子生物學的方法檢測重組蛋白的高效表達和積累操作繁雜，耗時耗力且需要破碎細胞。為了尋找一種簡單快速，不需破碎細胞，且能實時檢測FDH 重組蛋白在基因工程菌中表達情況的方法，本研究應用單細胞激光拉曼光譜分析技術( LTRS) ，研究IPTG 誘導不同時間后甲酸脫氫酶重組蛋白( FDH) 在大腸桿菌細胞中的表達水平。結果表明，FDH 的特征峰1004， 1355， 1455 和1667cm!1 隨著IPTG 誘導時間的延長而增強，說明在誘導培養過程中FDH 重組蛋白在重組大腸桿菌細胞中表達并積累，這4 個峰強的增加值所反映的FDH 表達量與SDS-PAGE 電泳分析結果一致。實驗結果證明，LTRS是快速有效檢測單個大腸桿菌活細胞體內重組FDH 實時表達的一種非入侵方法。
甲酸脫氫酶( Formate dehydrogenase，FDH，EC1． 2． 1． 2) 是廣泛存在于各種生物體中一種依賴NAD+的重要酶［1］。研究表明，NAD+依賴型FDH 在甲基營養菌生物合成和能量代謝中起重要作用。甲基營養菌能利用和代謝氯化物，氯化物在甲基營養菌細胞中首先被氧化為甲醛，然后進入到異化途徑，經過一系列反應，最終氧化生成CO2，或進入同化途徑，轉變為細胞的組成成分。作為甲醛異化代謝的最后一步關鍵酶，FDH 將甲酸氧化為CO2，同時將NAD+ 還原成NADH，還原的NADH 為這些微生物提供了所需的能量［2］。由于FDH 催化的反應可以再生NADH，因此在工業生產中有著重要的應用價值。目前，工業上應用的FDH 可以通過構建高水平表達重組FDH 蛋白的基因工程菌來生產［3，4］。檢測重組蛋白的高效表達和積累，一般利用分子生物學的方法有SDS-PAGE、Western blotting 和質譜等方法，這些方法操作繁雜，耗時耗力，樣品需要染色標記，甚至破碎細胞。單細胞光鑷拉曼光譜技術( LTRS) 的應用，使得溶液中單個活細胞的生理生化變化過程的研究成為可能［5］。由于生物大分子，如核酸、蛋白、脂類和糖類等，都具有特異的拉曼光譜。從這些特征的光譜中可以獲取細胞生物大分子的組成、結構及生理狀態等重要信息［6，7
］。Chan 等［8］首次應用LTRS 研究用異丙基硫代半乳糖苷( Isopropyl thiogalactoside，
IPTG) 誘導單個重組大腸桿菌細胞表達髓鞘少突膠質細胞重組糖蛋白( Myelin oligodendrocyte
glycoprotein，MOG) ，結果顯示，蛋白質的拉曼特征峰1257，1340，1453，和1660 cm!1 的峰強隨著IPTG 誘導時間的延長而增加，這種變化主要是IPTG 誘導MOG 的過量表達所致。Xie 等［9］利用單細胞激光拉曼光譜( LTRS) 成功快速地檢測出斑馬魚β 生長乳素重組蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母細胞中的表達，通過LTRS 發現活體單細胞內重組蛋白的表達量隨著時間延長而增多，且在細胞內累積，并對該重組蛋白表達進行定量分析。與傳統的SDS-PAGE 相比，LTRS 單細胞技術檢測重組細菌重組蛋白的表達，不需要破碎細胞，也不需要染色標記，樣品制備過程簡單，樣品需要量少，可以在單細胞水平上研究活體細胞重組蛋白的表達，具有非破壞性和檢測速度快的特點。本研究利用已經構建好重組質粒pET28a-fdh 轉化大腸桿菌Escherichia coli Rosetta，應用LTRS 研究IPTG 誘導單個大腸桿菌活體細胞中重組蛋白FDH 的實時表達，為分析基因工程菌中FDH 的表達提供一種簡單快速，且不需要破壞細菌細胞的方法。