按下一步驟的要求重溶解沉淀物。
二、cDNA 的合成
1.加入 10ul 經 DEPC 處理水重溶 RNA 沉淀物，加入 1ul（10ug）T7digo（dT)18。
2.95℃ 水浴 2 min 使 RNA 變性，在冰上快速冷卻。
3.加以下物質：
4.37℃ 溫育 lh。
5.加以下物質：
6.16℃ 水浴溫育 2 h。
7.按上述 RNA 的分離第 7~19 步進行酚/氯仿/異戊醇抽提、氯仿/異戊醇抽提以及乙醇沉淀。
8.加入 10ul 水重溶雙鏈 cDNA 沉淀物，用 50 ml TE 液（無 RNA 酶）透析 4 h(溫和地將 cDNA 轉移到 0.025um 微孔濾器上，濾器浮于含 50 ml 無 RNA 酶 TE 液的錐形管中。4 h 后將樣本轉移到 1.5 ml 的反應管中，用 5 經 DEPC 處理過水漂洗濾器，并將洗液加入同一管中)。
三、aRNA 的合成
1.每 15.2ul 上述步驟所得雙鏈 cDNA 溶液中加入以下物質：
2.37℃ 溫育 4 h。
3.加入以下物質：
4.37°C 溫育 30 min。
5.按上述 RNA 的分離第 7~19 步進行酚/氯仿/異戊醇抽提、氯仿/異戊醇抽提以及乙醇沉淀。
四、從 aRNA 合成 cDNA
1.加入 10ul 經 DEPC 處理水重溶 aRNA 沉淀物, 然后加入 1ul(10ng) 六核酸引物。
2.95°C 水浴 2 min 使 aRNA 變性，在冰上決速冷卻。
3.加以下物質：
4.37℃ 溫育 lh。
5.按上述 RNA 的分離的第 7~19 步進行酚/氯仿/異戊醇抽提、氯仿/異戊醇抽提以及乙醇沉淀。
6.按上述 cDNA 的合成的第 8 步進行透析。
7.把 cDNA 轉移到干凈的反應管后，加入經 DEPC 處理水至終體積 50ul。
五、DD-PCR
1.在 0.5 ml 反應管中加入以下物質：
2.當所用的熱循環儀沒有預熱頂蓋時，可以在反應管中加一滴植物油，以防止水分蒸發。
3.將反應管放入預先加熱到 94℃ 的熱循環儀，進行 PCR 前先溫育 3 min。
4.循環 40 次。
5.加 8pd 甲酰胺加樣緩沖液，94°C,5 min 使 DNA 變性。
6.5% 變性聚丙烯酰胺測序凝膠電泳，每孔加樣 6ul 走膠，直至二甲苯青 FF 達凝膠全長的 3/4 處。
7.用塑料薄片覆蓋濕凝膠，無須固定，放射自顯影過夜，用熒光墨水標記凝膠四角。
8.利用突光點作為標志物準確排列經曝光膠片和凝膠，切下目的膠條，放入干凈的 1.5 ml 反應管中。
9.每個膠條中加 500 凝膠洗脫緩沖液，95℃ 水浴 10 min, 室溫放置 16 h。
10.取 200ul 含目的 PCR 產物的凝膠洗脫緩沖液，加入干凈的 1.5 ml 反應管中，加 1ul(10ul）的糖原，按上述 RNA 的分離第 7~19 步沉淀 DNA。
11.用 10ul 經 DEPC 處理水重溶 DNA 沉淀物。PCR 產物此時可在-20°C 儲存，小部分樣品（如 1~3ul) 可用于重新擴增（引物同 DD-PCR 反應）以及隨后克隆或測序。重新擴增時 PCR 循環的次數嚴格根據初始 PCR 產物從聚丙烯酰凝膠中的回收率而定。一般來說，20~40 個循環可以獲得足夠的產物用于后續的克隆。我們推薦使用市售試劑盒來直接克隆經重新擴增的 PCR 產物，如 Invitrogen 公司的 TOPOTA 克隆試劑盒。
