險測突變的目的主要是為弄懂人類遺傳性疾病的分子機制，以便有效的針對這些疾病進行預防、診斷和治療，但更多的是用于分析不同生物體基因型與表型之間的關聯。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 試劑、試劑盒 | 擴增緩沖液dNTP 混合溶液甲酰胺上樣緩沖液蔗糖凝膠緩沖液TBE 電泳緩沖液限制性內切酶熱穩定 DNA 聚合酶人類基因組 DNA正向引物和反向引物[a-32P]dCTP丙烯酰胺雙丙烯酰胺過硫酸胺甘油TEMED |
|---|
| 儀器、耗材 | 帶屏障裝置的自動移液器吸頭沸水浴電泳板、破璃和 0.4 mm 隔條干膠設備玻璃毛細管Hamilton 注射器微量離心管可調式移液器熱循環儀水浴Whatman3 MM 濾紙 |
|---|
| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。
10x 擴增緩沖液
含 4 種 dNTP, 每種濃度為1mml/L(PH7.0) 的 dNTP 混合溶液（PCR 級）
甲酰胺上樣緩沖液
蔗糖凝膠緩沖液（緩沖液類型 I)
10XTBE 電泳緩沖液
用 1X 工作強度的 TBE(89 mmol/L Tris-硼酸鹽，2 mmol/L EDTA) 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。1xTBE 濃度能提供必需的緩沖能力。緩沖液的 PH 值一般應為 8.3。通常不需要調節 pH 值，然而當使用實驗室新制備的 10XTBE 緩沖液時，應檢査 pH 值變化。
用同一種 10XTBE 貯存液制備凝膠和跑膠緩沖液。離子強度和 pH 值的微小變化將產生緩沖液對抗。使 DNA 帶型發生極大的扭曲。
酶和緩沖液
限制性內切酶（選用）
熱穩定 DNA 聚合酶
推薦使用 Taq DNA 聚合酶
核苷酸和寡核苷酸
用于篩選點突變的人類基因組 DNA
將 DNA 以 10ug/ml 在 TE(pH7.6) 緩沖液中。
寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物（每種濃度為 35umol/L) 溶在 TE 中 (pH7.6)
放射性物質
[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)
凝膠
丙烯酰胺：雙丙烯酰胺（29:1;m/V)
許多研究者使用商業化的預制丙烯酰胺和雙丙烯酰胺溶液（例如.Acrylogel BDH）。然而，使用 Hydrolink 系列凝胺基質（Molinarif et al.1993) 可獲得最好的分辨率，它的商業化名稱是 MDE(Mutation Detection Enhancement), 產品是由 FMC 生物制品公同（Rockland,Maine) 制造。
過硫酸胺（10%w/V)
甘油
使用高純度級別的甘油，例如超純的（Life Technologies)。請見關于甘油的信息欄。
TEMED(四甲基乙二胺）
許多廠商. 包括 Sigma 公司和 Bio-Rad 公司出售電泳級的 TEMED。TEMED 易吸濕，應貯存在密封的容器中，4°C 溫度下保存。
TEMEU 的作用是輔助催化丙烯酰胺聚合。
專用設備
帶屏障裝置的自動移液器吸頭
沸水浴
電泳板、破璃（兩塊 40 cmX40 cm 的玻璃）和 0.4 mm 隔條。
干膠設備
玻璃毛細管（拉長）或帶凝膠上樣吸頭的微量移液器
Hamilton 注射器或巴斯德移液器
微量離心管（擴增闬 0.5 ml 薄壁管）
可調式移液器
能夠按擴增方案設定程序的熱循環儀
如果熱循環儀不帶加熱蓋裝置，使用輕礦物油或石蠟防止 PCR 過程中反應混合物的液體揮發。
限制性內切核酸酶消化所需溫度的水浴
Whatman3 MM 濾紙
方法
擴增用于篩選點突變的 DNA
1. 按順序在一個消毒的離心管中混合下列成分:
1 mmol/LdNTP 溶液 1ul
10x 擴增緩沖液 2ul
35umol/L 5'-寡核苷酸溶液 1ul
35umol/L 3'-寡核苷酸溶液 1ul
10uCi/ul[a-32Pld-CTP 1ul
人的基因組 DNA 10ul(100ng)
熱穩定 DNA 聚合酶 1~3 單位
加水至 20ul
在 PCR 過程中 [a-32P]dCTP 被均勻地結合并標記到擴增的 DNA 中。用 32P 標記的寡核苷酸引物代替 [a-32P〕dCTP 產生末端標記的 DNA。
如果可能，設置二組已知的在等位基閑序列上含有個或多個堿基不同的而且已知在 SSCP 膠上能夠分辨出來DNA 樣品作為對照。為避免發生污染需另外設置一個不加模板 DNA 的陰性對照
2. 如果熱循環儀不帶加熱蓋裝置，加入 1 滴（約 50ul) 輕礦物油覆蓋反應混合物以防止在反復加熱和冷卻循環過程中樣品蒸發。若使用熱啟動程序，可在管中加入一滴石蠟油。將反應管置于熱循環儀中。
3. 按下列表中列出的變性、退火、聚合時間和溫度進行擴增。熱循環參數的設定請參考第 8 章方案 I。
上述反應條件適合于 50ul 反應體積、0.5 ml 薄壁管和 Perkin-Elmer9600、9700 ，Master Cyder(Eppendorf) 或PTC100(MJ Research) 熱循環儀。使用其他類型的儀器或不同的反應體積時需調整上述反應條件。
制備 SSCP 凝膠
4. 當開始 PCR 反應時，用含 10%(V/V) 甘油的 lxTBE 緩沖液制備 5.5% 的聚丙烯酰胺凝膠。
10XTBE 凝膠緩沖液 10 ml
29:1 丙烯酰胺: 雙丙烯酰胺溶液 18 ml
10% 過硫酸胺 0.5 ml
甘油 10 ml
加水至 61.5 ml
溫和攪動以混合以上試劑。
上述體積的溶液足夠灌制一塊標準大小（40 cmX40 cm）墊片厚度為 0.4 mm 的凝膠。可增加或降低凝膠溶液體積制備所需大小的凝膠。
用相同的 10XTBE 貯存液制備足以填滿凝膠電泳裝置的 1XTBE 凝膠緩沖液。
5. 把兩快 40 cmX40 cm 玻璃電泳板和 0.4 mm 墊片裝配并沾合在一起。
為了獲得單鏈 DNA 構象異構體的最大分辨率，應使用凝膠厚度等于或小于 0.4 mm 的墊片。
6. 加入 100ul TEMED 溶液，溫和搖晃三角瓶，混合溶液并灌制凝膠。
丙烯酰胺溶液聚合速度很快，因此操作要迅速，灌制薄膠的方法請見第 12 章方案 8。
7. 室溫下把已經聚合的凝膠放到電泳裝置中。電泳糟中加滿與制備凝膠緩沖液相同的1XTBE 緩沖液。
制備 SSCP 電泳樣品
8.(可做可不做）當 PCR 反應結束時取出反應管置于冰上，若擴增 DNA 片段需要用限制酶消化，設置下列酶切反應
PCR 溶液 5ul
限制性緩沖液 4ul
限制性內切酶 (2~50 單位） 2ul
水 29ul
在適合限制酶消化的溫度下孵育 1~2 h。
9. 用蔗糖凝膠上樣緩沖液將 1.5ul 原始 PCR 產物（步驟 3) 或 5ul 限制酶消化的 PCR 產物（步驟 8) 稀釋至 20ul。用甲酰胺染料混合物將相同量的樣品稀釋至 20ul。
用甲酰胺染料混合物稀釋的樣品將被變性，而用蔗糖凝膠緩沖液稀釋的樣品保持雙鏈用作對照。
10. 將含甲酰胺的樣品煮沸 6 min, 然后直接把反應管插入冰中。
SSCP 凝膠電泳分離和分析 DNA 片段
11. 使用巴斯德滴管或漢密爾頓注射器吸取 1XTBE 緩沖液沖洗聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔。用一個拉長的玻璃毛細管或帶有凝膠上樣吸頭的微量移液器分別取 2ul 樣品加到聚丙烯酰胺凝膠電泳上。
12, 使用電壓為 6~7V/cm[約 250V(和 15mA) 對于 40 cmX40 cm 凝膠]，電泳 14 h。
13. 電泳完成后，分離玻璃板，將凝膠轉移至 1 層 Whatman3 MM 濾紙上，真空干燥30~60 min。
14. 對干凝膠進行放射自顯影，在無增感屏的情況下室溫曝光 4~16 h。
非變性 PCR 樣品（即，用蔗糖凝膠上樣緩沖液稀釋的樣品）以雙鏈 DNA 的形式在凝膠中遷移。相比之下，變性樣品（即與甲酰胺染料混合物混合并進行煮沸的樣品）將以雙鏈和單鏈混合物的形式在凝膠中遷移。單鏈 DNA 通常在丙烯酰胺凝膠中的遷移率低于雙鏈分子（Majwm and Gilbert 1977，1980;Szalay et al.1977)。在兩條 DNA 互補鏈折疊形成的抅型不能被 SSCP 分辨的情況下，有-條單鏈條帶能被檢測到。如果互補鏈折疊成可以分辨的構型. 兩條鏈都能被檢測到。二倍體生物的雜合等位基因的 PCK 產物產生至少 4 條帶，兩條帶與野生型遷移率相同，另外兩條帶為特異的突變體。然而、往往會出現多于兩條帶的情況，既可能是樣品遺傳非均一性的結果，也可能是由于同一 DNA 分子的兩條互補鏈自身折疊形成了多于一種形態的構象。帶型相當復雜，而且很難從 DNA 序列、堿基組成和片段的長度來推算。然而，對于一種特定的誘變通常會有一種具有特征的帶型。
|
|---|
