卡爾費休法測定各種物質中微量水分的原理：在水存在時，即樣品中的水與卡爾費休試劑中的SO2與I2產生氧化還原反應。
I2 + SO2 + 2H2O → 2HI + H2SO4
但這個反應是個 可逆反應，當硫酸濃度達到0.05%以上時，即能發生逆反應。如果我們讓反應按照一個正方向進行，需要加入適當的 堿性物質以 中和反應過程中生成的酸。經實驗證明，在體系中加入 吡啶，這樣就可使反應向右進行。
3 C5H5N+H2O+I2+SO2 → 2 氫碘酸吡啶+硫酸酐吡啶
生成硫酸酐吡啶不穩定，能與水發生反應，消耗一部分水而干擾測定，為了使它穩定，我們可加無水甲醇。
硫 酸酐吡啶 + CH3OH（無水）→ 甲基硫酸吡啶
總反應式：
I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH 2氫碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶
從反應式可以看出1mol水需要1mol碘，1mol二氧化硫和3mol 吡啶及1mol甲醇而產生2mol 氫碘酸吡啶、1mol甲基硫酸吡啶。這是理論上的數據，但實際上，SO2、吡啶、CH3OH的用量都是過量的，反應完畢后多余的游離碘呈現紅棕色，即可確定為到達終點。
I2∶SO2∶C5H5N = 1∶3∶10