1.病原學診斷 可收集痰液或支氣管分泌物涂片鏡檢，但陽性率很低，應用支氣管沖洗術可提高檢出率。也可進行經皮穿刺肺活檢、支氣管鏡肺活檢或開胸肺活檢，這些方法雖可靠，但損傷大。
2.免疫學診斷 常用方法為IFA、ELISA或補體結合試驗。但由于大多數正常人都曾有過肺孢子蟲隱性感染，血清中都有特異性抗體存在，故檢測血清抗體的方法一般不用于肺孢子蟲病的診斷。
DNA探針、rDNA探針和PCR技術等已試用于肺孢子蟲病診斷，顯示有較高的敏感性和特異性。
