用無菌接種環取破傷風梭菌肉渣培養物,分區劃線接種于血瓊脂平板上,取方形玻璃板一塊,中央置無菌紗布塊,放1克焦性沒食子酸于紗布上,然后再向紗布上滴加10%NaOH約1毫升,焦性沒食子酸與堿性溶液混合后,可以吸收氧氣變為棕黑的焦性沒食子橙而造成厭氧環境,立即將種有細菌之平板倒蓋于方形玻璃板上,并在平板四周用熔化石蠟密封。置37 ℃溫箱中培養24~48小時后,取出觀察結果。