一 摘要：
1．1 實驗內容：
厭氧菌的分離、培養及鑒定；
1．2 目的：
1 掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。
了解厭氧菌菌鑒定的一般方法。
2 復習并鞏固平時所學的微生物知識與技能。
3 培養獨立思考、設計和動手實驗的能力。
二 介紹：
厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。
專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。
厭氧菌的培養：
在培養厭氧菌時，最需要控制的是厭氧條件，在pH=7.0,O2的濃度與1atm的氧平衡時，O2——O2-反應的電位是0.81V，因此，在-0.33V時，O2濃度是大氣壓中O2濃度的10-75。每升飽和了空氣的水中含有1.48×10-55個O2。所以說，要保證厭氧菌培養時的低電位是很重要的。
厭氧菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術
因此他是世界上第一個分離純化厭氧菌的人。
以后這項技術又經歷了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善，并逐漸發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術，而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。該技術的優點是：預還原培養基制好后，可隨時取用進行試驗；任何時間觀察或檢查試管內的菌種都不會干擾厭氧條件。
三 實驗材料與設備：
3．1 分離與培養：
3．1．1菌種：待測樣品；
3．1．2 培養基：改良的PRAS培養基(氮素自加）
[配方組成——NH4CL
1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4
0.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值為7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹脂刃天青（還原指示劑）1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養基加入1%Na2S（還原劑）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制劑）各0.1ml]
3．1．3 試劑：冰塊 Na2S NaHCO3
3．1．4 器材：高純氮氣 厭氧管 厭氧手套箱 注射器 恒溫培養箱 銅柱除氧系統 定量加樣器 厭氧罐 超聲波破碎儀 酒精燈 冰塊 水浴鍋 記號筆 振蕩器 等
3．2 菌種的鑒定：
3．2．1 菌種：待測菌
3．2．2 培養基；糖發酵培養基、蛋白胨水培養基、淀粉培養基（液體）；
3．2．3 試劑；乙醚 吲哚試劑 盧戈氏碘液；
3．2．4 器材：超凈工作臺 恒溫培養箱 高壓蒸汽滅菌鍋 接種環 移液管載玻片 顯微鏡 等
四、實驗方法與步驟：
4．1分離與培養
4．1．1 銅柱系統除氧
銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小為40～400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2
和H2等都含有微量O2，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變為黑色。當向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的氧就結合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復的使用，并不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發生器產生。
4．1．2 預還原培養基及稀釋液的制備
在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，制作預還原培養基及稀釋液時，先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色，說明試管內已成為無氧狀態，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，于滅氧罐中滅菌備用。