材料的固定
在原位雜交中，要獲得清晰完整的超微結構圖像，最大限度地保持細胞內的DNA或RNA分子的完整性，使探針容易進入細胞或組織，選擇合適的固定劑及固定時間對新鮮的組織迅速固定是至關重要的。
常用的固定劑如戊二醛，甲醛等交聯性固定劑能較好地保持細胞和組織的超微結構，也能有效地保存組織細胞中的核酸，但它們會和細胞漿內的生物大分子產生交聯，影響探針的穿透力。而多聚甲醛等非交聯性固定劑顯然對探針具有很好的穿透性，但對核酸及超微結構的保存卻較差。因此在實驗中應試用不同的固定劑或它們的組合，以探求最合適的固定條件。現在文獻中一般多推薦使用4%的多聚甲醛加0.5%的戊二醛作為固定液。
至于固定時間一般認為以2~4h為宜。固定的時間過長會影響探針的的穿透力，減小雜交率；過短，則會對超微結構產生危害。Jing Y等對鼠腎樣品進行不同時間的固定，發現固定4h的樣品可以達到雜交信號和超微結構保存的最佳結合。