原位雜交(InSituHybridization,ISH)與熒光原位雜交（一）

是用標記的核酸探針，使用非放射檢測系統或放射自顯影系統，在組織切片、細胞涂片及染色體制片上等對核酸進行定性、定位和相對定量研究的一種分子生物學方法，具有靈敏、特異、直觀等優點。已逐漸成為分子生物學和分子病理學的常見技術之一，廣泛應用于腫瘤生物學、血液病理學、遺傳、微生物學、細胞和分子生物學、神經內分泌學、免疫學等領域及治療評估和預后判斷等研究中。
菌落原位分子雜交：是指將轉化或感染后的菌落印影在濾膜上，用堿裂解，中和后洗凈烘干，再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探針(Probe)進行雜交放射自顯影，凡出現黑點的菌落即應中選。

二、熒光原位雜交(Fluorescence in situ Hybridization)

是原位雜交技術大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質標記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末被發明，現已從實驗室逐步進入臨床診斷領域。基本原理是熒光標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復性；通過工業區光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平的分析。在該領域中產品頗具名氣的公司之一為美國Vysis公司，它是一家專業生產FISH產品的公司，其產品涉及到熒光標記探針，雜交，檢測用試劑，雜交用儀器，觀察分析用儀器用及軟件等，幾乎涵蓋FISH技術所需的所有試劑和設備。

熒光標記控針不對環境構成污染，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，縮短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。Vysis公司的熒光標記探針均為直接法標記，可省去信號放大系統，減少試劑投入且保障更大程度的特異性，同時也有信號清晰，背景低及方法簡單易于操作等優點。

附錄：核酸分子雜交的類型

隨著基因工程研究技術的迅猛發展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現和完善。核酸分子雜交可按作用環境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。

由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優點，故該法最為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交是一種研究最早且操作復合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術的不斷改進，商業性基因探針診斷盒的實際應用，推動了液相雜交技術的迅速發展。下面對固相雜交和液相雜交分別進行介紹。

（一）固相膜核酸分子雜交方法

固相核酸雜交多是在膜上進行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法：

1．DNA的變性　DNA變性解鏈是雜交成功的關鍵。Southern印跡雜交時 DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發生變性，但強酸會使核酸降解。一般認為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0）下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調pH到7～8[亦可用堿變性后，調至中性，再加熱100℃10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%）來檢測，變性 DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。

2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定　硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。

3．預雜交　濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預熱至60℃的預雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調濃度至10mg/ml，用前放100℃水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴保溫3~12h。當預雜交液溫度升至68℃時，在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預雜交液很重要。
4．雜交　從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口，雜交反應在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。