原位雜交(InSituHybridization,ISH)與熒光原位雜交（二）

5．洗膜　取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和 0.5%SDS溶液的盤中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動）。然后將濾膜移入 0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續保溫30min。

洗膜的溫度一般應控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 0.41x(G C) %）。雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數每增加1%而遞減1℃。

6．結果顯示　非放射性檢測方法前已述及，此處主要介紹放射性測定方法。固相膜的放射性雜交結果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計數法。前一種方法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數小時至數天，再顯影、定影即可。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強曝光強度。此外，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進行。液閃計數法主要用于打點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入 2～5ml閃爍液，剪2～3塊無樣品膜塊作為本底對照。在液體閃爍計數器上自動計數。液體計數測定放射性強度也可在放射自顯影之后進行。

（二）固相核酸分子雜交類型

1．菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）　菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。

實驗步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。

②培養細菌至產生1～2mm大小的菌落。

③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面上在，注意防止在濾膜底面存有氣泡。

④5min后，將濾膜轉至用變性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉至中和溶液（1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ，pH8.0）浸濕的濾紙上，放置10min。重復中和1次。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。

⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。

以下操作參考前述。

2．斑點雜交（Dot blot） 斑點雜交法是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。