原位雜交(InSituHybridization,ISH)與熒光原位雜交（五）

⑦60伏電泳過夜。

⑧取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

⑨室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉印。

⑩室溫下將膠浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使膠中和。

⑾20×SSC洗膠1h。

⑿20×SSC中過夜，轉印到硝酸纖維素膜上。

⒀取出硝酸纖維膜，80℃真空烘烤2h。

5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）　組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補序列在胞內的空間位置，這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質內的功能排布；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針的長度以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉錄標記的RNA探針是組織原位雜交的優選探針。

探針的標記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S最為常用。3H標記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位， 缺點是能量低。35S標記探針活性較高，影像分辨率也較好。而32P能量過高，致使產生的影像模糊，不利于確定雜交位點。

原位雜交中，標本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標本組織蛋白質的消化程度對探針進入細胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術，發展很快，在敏感性、特異性和穩定性上還需要進一步完善和提高（詳見二十章）。

6．固相夾心雜交

Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進一步的改進。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優點：①樣品不需要固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；②用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產生可檢測的信號。

固相夾心雜交需要兩個靠近而不互相重疊的探針，一個作固相吸附探針，另一個作標記檢測探針。樣品基因組內核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結構。需注意的是兩個探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內，以避免產生高的本底信號（如一個克隆人Puc19,另一克隆人pBR322）。