原位雜交(InSituHybridization,ISH)與熒光原位雜交（六）

夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進行標準化試驗和更容易對小量樣品進行操作。Dahlen 等利用微孔板進行夾心雜交，可同時進行大量樣品檢測，他們先吸取DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上。用微孔板進行夾心雜交還可直接用于PCR技術。應用光敏生物標記探針檢測PCR產物的敏感性和用32P標記探針（3×108cpm/μg）作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優點還包括同時做多份樣品，加樣、漂洗和讀結果等步驟可以自動化。

7．其它雜交類型

（1）固化探針雜交：該法較少使用，原理是使未標記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結合，漂洗后，用酶標抗DNA：RNA抗體或抗 DNA：DNA抗體與雜交物結合。將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物顯色并進行測定。探針濃度2μg/ml,80℃雜交，可在10～15min 完成，檢測的敏感性為5×108靶序列。

（2）反向雜交：這個雜交類型是用標記的樣品核酸與未標記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優點是在一次雜交反應中，可同時檢測樣品中幾種核酸 。這種雜交方式主要用于進行中的核酸轉錄試驗和多種病原微生物的檢測。前者是在轉錄過程中標記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標記樣品核酸。
（三）液相核酸分子雜交類型

1．吸附雜交

（1）HAP吸附雜交：羥基磷灰石（HAP）層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法。在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上。通過離心使吸附有核酸雙鏈的HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計數器上進行放射性計數。

（2）親合吸附雜交：生物素標記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到酰化親合素包被的固相支持物（如小球）上，用特異性抗 DNA：RNA雜交物的酶標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應，加入酶顯色底物，這個系統可快速（2h）檢測RNA。

（3）磁珠吸附雜交：Gen – probe公司最近應用吖啶翁酯（acridinium ester）標記DNA探針，這種試劑可用更敏感的化學發光來檢測。探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體上）。溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學發光測定。

2．發光液相雜交

（1）能量傳遞法：Heller等設計用兩個緊接的探針，一個探針的一端用化學發光基團（供體）標記，另一個探針的一端用熒光物質標記，并且這兩個探針靠得很近。兩個靠得很近的探針用不同的物質標記（標記光發射），當探針與特異的靶雜交后，這些標記物靠得很近。一種標記物發射的光被另一種標記物吸收，并重新發出不同波長的光，調節　檢測器使自動記錄第二次發射光的波長。只有在兩個探針分子靠得近時，才能產生受激發光，因此這種方法具有較好的特異性。

（2）吖啶翁酯標記法：吖啶翁酯標記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標記探針分子上的吖啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學發光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點是檢測的敏感度低（約1ng的靶核酸），僅適用于檢測擴增的靶序列，如rRNA或PCR擴增產物。

3．液相夾心雜交

（1）親合雜交：在靶核酸存在下，兩個探針與靶雜交，形成夾心結構，雜交完成后，雜交物可移到新的管或凹孔中，在其中雜交物上的吸附探針可結合到固相支持物上，而雜交物上的檢測探針可產生檢測信號。用生物素標記吸附探針，用125I標記檢測探針，這個系統的敏感性可檢測出4×106靶分子。該試驗保持了固相夾心雜交的高度特異性。

（2）采用多組合成探針和化學發光檢測：第一類探針是未標記的檢測探針和液相吸附探針，它們有50個堿基長，其中含有30個細菌特異序列堿基和20 個堿基的單鏈長尾；第二類探針是固相吸附探針，它可吸附在小珠或微孔板上。未標記檢測探針的單鏈長尾用于結合擴增多個標記探針，液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上，典型的試驗可用25個不同的檢測探針和10個不同的吸附探針。第一個標記檢測探針上附著很多酶（堿性磷酸酶或過氧化物酶）可實現未標記檢測探針的擴增。使用化學發光酶的底物比用顯色反應酶的底物更敏感。這個雜交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質粒抗性的檢測，敏感性達到能檢測5×104雙鏈DNA分子。

4．復性速率液相分子雜交　　這個方法的原理是細菌等原核生物的基因組DNA通常不包含重復順序。它們在液相中復性（雜交）時，同源DNA比異源DNA的復性速度要快。同源程度越高，復性速率和雜交率越快。利用這個特點，可以通過分光光度計直接測定變性DNA在一定條件下的復性速率，進而用理論推導的數學公式來計算DNA-DNA之間的雜交（結合）度。