原位雜交(InSituHybridization,ISH)與熒光原位雜交（四）

（2）硝酸纖維素濾膜吸印。

①將膠切成合適大小，切去右上角作為記號。

②將膠放進盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH）的盤中輕搖動15min。

③換到中和緩沖液（1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl）中輕搖動30min。

④裁一張硝酸纖維素膜，2～4張3MM濾紙和一些吸印紙（可用衛生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路），先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC中，接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴橡膠手套操作。

⑤平盤上放一塊比膠大的平板（盛膠槽翻過來即可），上面鋪一張3MM濾紙，起燈芯作用，盤中加少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚），不能沒過平板，使3MM濾紙充分飽和。

⑥將膠倒扣到3MM濾紙上。
⑦浸濕的硝酸纖維素鋪在膠上，對齊，鋪膜時從一邊逐漸放下，防止產生氣泡，有氣泡時，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。

⑧膜上放一張3MM濾紙，不能與膠接觸。

⑨上面加吸印紙及重物（500g左右）。

⑩通過濾紙的灶芯作用，平盤中的緩沖液就會通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉印過夜。

⑾去除上面的東西，用鑷了將膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗）。

⑿自然干燥，80℃烤2h。

⒀這時的膜就可進行雜交，或室溫密封保存。

4．Northern印跡雜交（Northern blot）　這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術由Southern于1975年創建，稱為Southern印跡技術。RNA印跡技術正好與DNA 相對應，故被趣稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為western blot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’-羥基基團。RNA變性后有利于在轉印過程中與硝酸纖維素膜結合，它同樣可在高鹽中進行轉印，但在烘烤前與膜結合得并不牢固，所以在轉印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進行Northern轉印，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含 5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA 信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mR－NA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免 RNase的污染。

下面介紹RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法：

（1）試劑

10×MSE緩沖液：0.2mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0, 50mmol/L 醋酸鈉，1mmol/l EDTA, pH8.0。

5×樣品緩沖液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L）。應在通風柜中操作，pH高于4.0。

去離子甲酰胺。

50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。

0.1mol/L Tris·HCl，Ph7.5。

（2）步驟

①40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml 10×MSE緩沖液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混勻后 倒入盛膠槽。

②等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。

③使RNA變性（最多20μg）：RNa 4.5μl，10×MSE緩沖液2.0μl，甲醛3.5μl，去離子甲酰胺10.0μl。

④55℃加熱15min，冰浴冷卻。

⑤加2μl 5×載樣緩沖液。

⑥上樣，同時加RNA標記物。