三、操作步驟
（一）取材、冰凍切片：
將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M
PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M
PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交專用玻片上，切片厚度為15-20μm。
（二）探針制備與檢測（定量）：
1．隨機引物制備cDNA核酸探針
以DIG DNA 標記檢測試劑盒為例：
（1）探針制備：
①模板DNA(0.5-3μg) 15μl，100℃變性10min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2μl, dNTPmix 2μl, Klenow Enzyme 1μl，反應總體積為20μl。37℃孵育過夜。
③在上述20μl的標記產物中加4M
LiCl 2.5μl, 75μl（無水乙醇預冷）,輕輕混勻，-20℃放置 2hr。4℃離心12000g×15min，棄上清。70%乙醇(預冷)
50μl洗滌，7500g×5min，棄上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解沉淀，-20℃保存備用。
（2）探針敏感性檢測：
①樣品稀釋：取dig-標記探針1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀釋。
②取一張與點樣器大小相近的尼龍膜，標記方向，ddH2O中浸泡 1min，6×SSC中浸泡10min，置點樣器上，負壓抽吸5min。
③將上述樣品點于尼龍膜上，繼續抽吸10min。
④取下尼龍膜，置紫外燈下10cm處照射5min，晾干。
⑤將膜置于適量預雜交液（5-10 ml）中，37℃預雜交10min。
⑥加入Anti-dig 抗體（1:5000），37℃雜交30min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。
⑧顯色：15 mlTSM2中加300μl顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30min。
1． PCR法制備cDNA核酸探針：
（１） 探針制備：
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：
在0.5ml離心管中，依次加入：
PCR 引物 1（10pM） 2μl
PCR 引物 1（10pM） 2μl
質粒DNA 模板（10-100pg） 2μl
PCR DIG mix 2μl
(含dNTP和DIG-11-dUTP)
dNTPmix 2μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
加入適量ddH2O，使總體積達50μl。
① 將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 45s → 58℃ 45s → 72℃ 60s，循環30-35次，最后在72℃ 保溫7min。
②
在上述PCR產物中加入4M LiCl 12.5μl、預冷無水乙醇375μl，輕輕混合后置于-20℃2hr,
12,000g×15min，棄上清。70%乙醇(預冷) 120μl洗滌沉淀，離心7500g×5min，棄上清，晾干沉淀,加TE
50μl溶解,-20℃保存備用。
（2）探針檢測：
行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測法）。
（三）原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：
1．0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
2．0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
3．0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
4．0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
5． 4%多聚甲醛浸5min。
6． 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
7．預雜交：滴加適量預雜交液，42℃ 30 min。
1． 雜交：傾去預雜交液，在每張切片上滴加10-20μl雜交液（將探針變性后稀釋在預雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟膜，42℃ 過夜。（陰性對照
2． 洗片：
(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；
0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC與0.1M PBS各半洗10min；
0.05M PBS 洗 5min×2次。
10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
11． 滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物（以抗體稀釋液1:5000稀
釋）4℃孵育過夜。
12． 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鮮配制TSM2 10min×2次。
13． 顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜。
14． 將玻片置于TE中10-30min以終止反應。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片。
15．顯微鏡下觀察結果。四、注意事項：
１． 作為DNA-RNA的雜交，需防RNase的污染。
cDNA探針在雜交時必須變性解鏈。具體方法是：將探針置100℃加熱5min，冰浴驟冷。