原位雜交實驗要求及步驟

新鮮組織或細胞樣品

PBS PB 甘氨酸 多聚甲醛 Denhardt溶液 抗體稀釋液 預雜交液 顯色液 無水乙醇

水浴鍋 離心機 尼龍膜 點樣器

（一）取材、冰凍切片：

將動物以3%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，暴露心臟，刺破右心耳，將針尖刺入左心室用生理鹽水灌注（灌注量約為動物體重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（見圖2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡沖洗4-5次（換液：1次/hr）。將組織塊入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰凍切片，將切片裱貼于原位雜交專用玻片上，切片厚度為15-20μm。

（二）探針制備與檢測（定量）：

1.  隨機引物制備cDNA核酸探針以DIG DNA 標記檢測試劑盒為例：

（1）探針制備：

①模板DNA（0.5-3 μg） 15 μl，100℃變性10 min，冰浴5 min。

②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2 μl， dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反應總體積為20 μl。37℃孵育過夜。

③在上述20 μl 的標記產物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（無水乙醇預冷，輕輕混勻，-20℃放置 2 hr。4℃離心12 000 g×15 min，棄上清。70%乙醇（預冷） 50 μl 洗滌，7 500 g×5 min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存備用。

（2）探針敏感性檢測：

①樣品稀釋：取dig-標記探針1 μl 用ddH2O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀釋。

②取一張與點樣器大小相近的尼龍膜，標記方向，ddH2O中浸泡 1 min，6×SSC中浸泡10 min，置點樣器上，負壓抽吸5 min。

③將上述樣品點于尼龍膜上，繼續抽吸10 min。

④取下尼龍膜，置紫外燈下10 cm 處照射5 min，晾干。

⑤將膜置于適量預雜交液（5-10 ml）中，37℃預雜交10 min。

⑥加入Anti-dig 抗體（1：5000），37℃雜交30 min。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室溫洗10 min×2次。

⑧顯色：15 ml TSM2中加300 μl 顯色液（NBT/BCIP），37℃避光顯色30 min。

2.  PCR法制備cDNA核酸探針：

（1） 探針制備：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 為例：

在0.5 ml 離心管中，依次加入：

PCR引物 1（10 pM） 2 μl；

PCR引物 1（10 pM） 2 μl；

質粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；

PCR DIG mix 2 μl （含dNTP和DIG-11-dUTP）；

dNTPmix 2 μl；

10×PCR buffer 5 μl；

Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；

加入適量ddH2O，使總體積達50 μl。

① 將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執行擴增。

一般：在93℃預變性3-5min，進入循環擴增階段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s，循環30-35次，最后在72℃ 保溫7 min。

② 在上述PCR產物中加入4 M LiCl 12.5 μl、預冷無水乙醇375 μl，輕輕混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，棄上清。70%乙醇（預冷） 120 μl 洗滌沉淀，離心7500g×5 min，棄上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存備用。

（2）探針檢測：

行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察DIG-DNA探針含量（采用目測法）。

（三）原位雜交反應（以DIG-cDNA探針為例）：

1.  0.1 M PBS （pH 7.2） 浸 5-10 min。

2.  0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。

3.  0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。

4.  0.1 M PBS 洗 5 min×3次，加蛋白酶K（1 μg/ml），37℃孵育30 min。

5.  4%多聚甲醛浸5 min。

6.  0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。

7.  預雜交：滴加適量預雜交液，42℃ 30 min。

（1）雜交：傾去預雜交液，在每張切片上滴加10-20 μl 雜交液（將探針變性后稀釋在預雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟膜，42℃ 過夜。

（2）洗片：

4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；

0.2×SSC 37℃洗10 min；0.2×SSC與0.1 M PBS各半洗10 min；

0.05 M PBS 洗 5 min×2次。

10.  3% BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。

11.  滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過夜。

12.  0.05M PBS洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次； 新鮮配制TSM2 10 min×2次。

13.  顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜。

14.  將玻片置于TE中10-30 min以終止反應。酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片。

15.  顯微鏡下觀察結果。

雜交液：

雜交液內除含一定濃度的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。

雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。

所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達到提高雜交率的目的（尤其對雙鏈核酸探針）。

在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，以減低背景。

探針的濃度：

探針濃度依其種類和實驗要求略有不同，一般為0.5——5.0 μg/ml（0.5——5.0 ng/μl）。最適宜的探針濃度要通過實驗才能確定。

探針的長度：

一般應在50-300個堿基之間，最長不宜超過400個堿基。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。

1.  組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30 min 內固定。

2.  固定目的是：

（1）保持細胞結構；

（2）最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；

（3）使探針易于進入細胞或組織。

最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。

3.  增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：

（1）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，以降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10 min，經乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙酰化而被阻斷。組織和細胞標本亦可用0.2 M HCl處理10 min，稀酸能使堿性蛋白變性，結合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。

（2）去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進入組織細胞，最常應用的去污劑是Triton X-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態結構，而且還會引起靶核酸的丟失。

（3） 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），還有鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4.  雜交緩沖液孵育：

雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2 hr，以阻斷玻片和標本中可能與探針產生非特異性結合的位點，達到減低背景的目的。

5.  防止污染：

由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤（180℃）以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經高壓消毒處理。

6.  雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：

雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進行雜交（包括檢測RNA時），雙鏈DNA探針在雜交前必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。