原位雜交實驗要求及步驟

原位雜交組織（或細胞）化學 （In situ Hybridization Histochemistry，ISHH） 簡稱原位雜交（In Situ Hybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。

根據探針的標記物是否直接被檢測，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術或成色酶促反應直接顯示。間接法一般用半抗原標記探針，最后通過免疫組織化學法對半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。

原位雜交最初是以同位素標記探針進行的。盡管同位素標記（如35S，3H，32P等）仍然廣泛使用，但非同位素標記探針的迅速發展（尤其是生物素標記探針和地高辛標記探針），更引起科技工作者的極大興趣。

一、基本要求

1.  組織取材：組織取材應盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30 min 內固定。

2.  固定目的是：

（1）保持細胞結構；

（2）最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；

（3）使探針易于進入細胞或組織。

最常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。

3.  增強組織的通透性和核酸探針的穿透性：

（1）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合，以降低背景，雜交前標本可用0.25%乙酸酐處理10 min，經乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙酰化而被阻斷。組織和細胞標本亦可用0.2 M HCl處理10 min，稀酸能使堿性蛋白變性，結合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。

（2）去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進入組織細胞，最常應用的去污劑是Triton X-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態結構，而且還會引起靶核酸的丟失。

（3） 蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），還有鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4.  雜交緩沖液孵育：

雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2 hr，以阻斷玻片和標本中可能與探針產生非特異性結合的位點，達到減低背景的目的。

5.  防止污染：

由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤（180℃）以達到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時所用的溶液均需經高壓消毒處理。

6.  雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：

雜交反應進行時，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進行雜交（包括檢測RNA時），雙鏈DNA探針在雜交前必須進行變性。探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。