二、生物素標記cRNA探針在原位雜交組織化學中的應用
（一）光敏生物素標記cRNA探針的應用
以線性質粒DNA為模板合成未加標記物的cRNA探針，使其最終濃度為0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再與等體積的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦鹵素燈下，距離光源20cm處照射30min。用仲丁醇抽提游離生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探針，將其溶于適量的滅菌雙蒸水，用紫外分光光度計測探針的光密度（詳第十九章 ），其最佳工作濃度為2μg/ml。
切片的制作、預處理、預雜交、雜交和雜交后沖洗的方法同概述中基本方法一節 。
光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序：
（1）石蠟切片脫蠟入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2沖洗5min；冰凍切片直接入PBS沖洗5min。
（2）0.1mol/l 甘氨酸PBS沖洗5min。
（3）0.4%Trition X-100 PBS 沖洗15min。
（4）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配）37℃保溫30min。
（5）4%多聚甲醛PBS固定5min。
（6）0.1mol/l PBS沖洗2×3min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（8）2×SSC沖洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 檸檬酸鈉）。
（9）取10μl含相應探針的雜交液滴于標本上，如果是cDNA探針則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上放入冰浴中冷卻，然后再用。
（10）蓋上22×22mm的硅化蓋片或合適大小的蠟膜，入溫盒43℃保溫12～16h。
（11）4×SSC洗脫蓋片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
（12）2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 適于RNA探針）沖洗30min，37℃。
（13）1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
（14）0.05mol/l PBS 沖洗4×5min。
（15）3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配）37℃保溫30min。
（16）Avidin –AKP(堿性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配）室溫1～3h。
（17）0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
（18）TSM1沖洗2×5min。
（19）TSM2沖洗2×5min。
（20）硝基四氮唑藍（NBT）0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）0.2mg/ml混合液顯色，室溫，暗處3h。
（21）20mmol/l EDTA,pH8.0終止顯色。
（22）甘油明膠直接封片。
結果：雜交陽性部位著藍黑色。
組織處理及預雜交所用器皿需高溫消毒，實驗者需戴手套。
（二）酶促生物素標記cRNA探針的應用
基本方法和放射性標記cRNA探針同，所不同的是探針濃度為2.5μg/μl。顯示探針反應步驟如下。
（1）用PBS沖洗粘附有切片的載片2×3min。根據情況也可用漂洗法。
（2）將載片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇內30min以封閉內源性過氧化物酶。
（3）PBS沖洗2×3min，用吸水紙拭干切片周圍的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30），室溫1h，或4℃過夜。
（4）PBS徹底沖洗。
（5）載片加生物素化抗小鼠IgG（1：100）30min室溫。
（6）PBS徹底沖洗。
（7）應用ABC復合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室溫。
（8）PBS徹底沖洗。
（9）將切片覆以新鮮配制的0.025%DAB溶液，0.02%H2O2,孵育3～15min。
（10）水洗，復染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用銀染，多層ABC或PAP法加強染色效果。
三、地高辛標記cRNA探針的應用
（一）基本原理
地高辛（Digoxigenin 簡寫Digo-）又稱異羥基洋地黃毒甙配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無交叉反應，地高辛配基標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成digoxigenin –11-dUTP（圖20-3）。通過隨機引物或缺口翻譯法（多用隨機引物法），將dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構成Dig-配基標記的核酸探針。將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯有酶或熒光素的羊抗高地辛抗體Tab（抗原結合片段）結合物作為酶標或熒光標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產生熒光以達到檢測目的，其反應過程見圖20-3。
圖20-3 地高辛標記的探針檢測酶聯免疫反應
常用的免疫酶學檢測方法有兩類：一是Dig –HRP（辣根過氧化物酶）檢測體系，以DAB（四氫氯化二氨基聯苯胺）/H2O2為底物，結果為棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2為底物，結果為藍色。另一是Dig –AKP檢測體系：以BCIP/NBT為底物，結果為藍紫色沉淀。與免疫細胞化學方法相似，如應用酶促反應會較單一信號的標記物如熒光素具有更高的靈敏度。同樣是酶促化學反應，AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優點為價廉、穩定。
應用地高辛標記的核酸探針也較穩定，據報告在-20℃貯存可達2年，隨時要取用，不像放射性標記探針有半衰期所致的時間限制。但在現實應用中，仍喜歡采用新鮮的地高辛配基標記3～6個月以內的核酸探針。為節 省核酸探針的用量，凡使用過的含有探針的雜交液也可反復多次使用，特別是對于已知的重復性實驗。對于細胞或組織內未知mRNA的檢測，仍宜采用未使用過的探針雜交液為佳。
與放射性標記相比，地高辛標記探針具有非放射性探針的優點，對人體無害，不受半衰期限制，探針可長期保存。與生物素標記探針相比，地高辛探針不受組織、細胞中內源性生物素的干擾，敏感性高。由于地高辛具有靈敏度及分辨率高，反應產物顏色鮮艷，反差好，背景染色低，制備探針可較長期保存，對人體無害等優點，已日益顯示出它的優越性和廣泛的應用前景。它不僅可應用于原位雜交細胞化學，還可應用于Southern印跡雜交法檢測特定基因組序列，進行RFLP分析用于基因診斷，菌落原位雜交，噬菌斑原位雜交，固定細胞及中期染色體原位雜交以及生物體液中，組織中病毒DNA序列的檢測。這一技術還被應用于檢測DNA標記物及測序，對人類染色體連鎖圖譜進行構建和基因圖譜分析。
（二）基本操作步驟
組織處理及預雜交等步驟與本章 中敘述的放射性同位素標記cRNA探針相同，但由于地高辛標記cRNA探針在原位雜交細胞化學中已愈來愈得到廣泛的應用，我們在基本方法中仍較詳細的敘述其操作過程。
1．組織前處理在組織制片中以冷凍切片（厚10～30μm）最佳。切片貼在預先清潔，高溫處理并涂以粘附劑載玻片上，先在37℃預干燥4h，然后置于37℃烤箱中過夜。經過上述處理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存數月之久，有報告可保存數年之久的。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片，應脫蠟經梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細胞內mRNA含量高時應用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經水洗后入37℃烤箱4h或過夜，然后進行雜交前處理。
在烘烤及低溫保存時，為防塵埃及空氣中RNA酶的污染，宜用錫箔紙（foilpaper）包被，內加少許干燥劑（變色硅膠）。
下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1）PBS洗2×3min。
（2）選擇少數幾張切片作為“RNA酶對照片”。
其它切片暫放于PBs 內。
RNA酶對照片處理方法：加RNA酶（100μg/ml）在預熱37℃的溶液內。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發皿內。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗，2×3min，然后與其它保存在PBS的切片一起進行下列處理。
（3）蛋白酶K消化：將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，內含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化時間應根據組織的種類，厚度反復試驗調整。時間過短探針不易進入，過長影響細胞或組織的形態結構。
（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6）以PBs 漂洗2×3min。
（7）浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封閉非特異性結合部位。
（8）2×SSC漂洗15min。
2．雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml）的雜交液，按每張切片10～2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml，用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟膜，置于盛有少量2×SSC溫盒內在42℃，16～18h或過夜。
3．顯示