（8）熒光顯示：
①生物素標記DNA探針的熒光顯示。
1）應用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片），也可用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結合部位。
2）移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm2）。在濕盒中，室溫孵育20min。抗生物素-FITC在此應用是過量的，因此，可回收貯存4℃再次應用，其保存時間可達數周。反應見圖20-4A直接法。
3）漂洗：PBs 2min×3，45℃。
4）如需放大（amplification）,即提高其敏感度，可按圖20-4B間接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody）30min室溫。傾去加另一層抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重復上述1）～3）。
②AAF標記核酸探針的熒光顯示
1）封閉非特異性結合部位：從PBS中取出載片，吸干多余液體，加PBS-0.1%吐溫（Tween）含2%正常羊血清（NGS）（5μl/每cm2蓋玻片）。使載片停留在室溫5min。
2）傾去多余液體，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i）5μl/cm2蓋玻片。室溫37℃。孵育30min.
3）漂洗：PBS-0.1%Tween室溫5min×3，間歇性振蕩。
4）羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3）應用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。
4．熒光標記DNA探針在細胞核混懸液雜交中的應用
（1）細胞核的分離：將培養的細胞制成細胞混懸液，或以胰蛋白酶消化法于培養蓋上收集培養細胞。應用MgSO4染色分離方法分離細胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 ）。細胞混懸液濃度為5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核從細胞分離，細胞核混懸液濃度為4～5×106細胞核/ml。
（2）細胞固定和酸的處理：在5ml試管內加冷的100%酒精不斷旋轉以達到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心（×150g）10min。重復加三次冷的100%酒精入試管內，離心，傾去。置于冰上10min，再離心。然后加入相當核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0）。再離心，重復IBM漂洗（這時細胞核可在不染色情況下，以熒光顯微鏡觀察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室溫靜置站立10min。傾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，離心，使細胞核混懸液最終濃度為108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍，在血球計數器計數），混懸液鏡檢應含單個，完整的細胞核。
（3）細胞核混懸液雜交
①配制雜交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH調至7.0。此原液（stock solution）可貯存在4℃冰箱內。應用時加1份10mg/ml鯡魚精子DNA（herring sperm DNA）。
②混合1μl的細胞核混懸液（108/ml）與18μl的雜交混合液，充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf 管中（核含量約為105）。
③加入100ng/每管的AAF標記DNA探針（如為生物素標記DNA探針濃度為20～40ng/每管）。
④置70℃10min使DNA探針和核DNA變性。
⑤和組織切片與DNA探針雜交方法相較，不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應，而應迅速轉入37℃孵育過夜。
（4）雜交后漂洗
①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42℃靜置10～15min。偶爾旋轉以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細胞（107/ml）混勻，離心，室溫，10min，輕彈試管使沉淀的小塊散開，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，繼之，靜置于室溫10～15min，如前離心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5min，離心。
注：DEMS處理紅細胞方法：經漂洗并離心去除白細胞和血清的紅細胞在鹽液如PBS中，細胞含量為108/ml，以K2CO3和DEMS溶液處理3次，第1次：K2CO3為20mmol/L,DEMS為3mmol/L，以后2次：K2CO3依然為20mmol/L，而DEMS為10mmol/L。在應用前將K2CO3和DEMS液混合加入紅細胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應用100mmol/l K2CO3將pH調至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的檸檬酸（citric acid）/每ml細胞混懸液的濃度以達固定紅細胞的目的。固定的紅細胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到108/ml，加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。
（5）AFF標記的熒光顯示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），輕輕振蕩混勻，室溫靜置10min，加20μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室溫靜置10min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC熒光標記抗血清，稀釋度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室溫靜置10min，離心，傾去上清液。
（6）生物素標記探針的熒光顯示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后，加20μl抗生物素標記FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10～15min，間歇振蕩、離心。
（7）熒光顯微鏡觀察：將細胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細胞核涂片上，選擇適當的激發波長觀察。
（8）流式細胞計：將750μl的細胞核混懸液通過流式細胞儀（Flow cytometry, FCM），DEMS處理過的紅細胞作為對照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。詳細操作見第十章 。
二、寡核苷酸探針的應用
寡核苷酸探針的優點在于它能根據需要人工用DNA合成儀合成，其長度及分子大小比較一致，可以控制。其長度一般較克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探針已能成功的為放射性同位素、熒光素、生物素和地高辛所標記，并成功地運用于培養細胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。雖然有些科技工作者認為其敏感度不如來自質粒擴增的cRNA或DNA探針，但由于探針制備簡便再加之于近年非放射性標記的成功，寡核苷酸探針在生物基礎醫學及臨床學科領域中得到較為廣泛的應用。
在原位雜交組織化學中應用寡核苷酸探針，其基本操作要點是相同的，如雜交溫度在Tm -25℃，雜交孵育時間以過夜（16h左右）為佳。應用寡核苷酸探針在原位雜交組織化學技術中的成功與否主要決定于探針的設計，使有效配對率增加而錯配（mismatch）減少。
（一）地高辛標記寡核苷酸探針的應用
1．組織處理
（1）冷凍切片：厚10～20μm，貼于事先經清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃，在應用于雜交實驗前，使迅速回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。
（2）石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min ×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每個濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
（3）離心細胞涂片：將細胞先以4%多聚甲醛固定，應用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應用PBS（含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。
2．探針準備35pmol的寡核苷酸（oligo -）探針，3’ 終末標記以地高辛-11–dUTP。
3．預雜交和雜交加約300μl預雜交液（配制法見附錄）在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA，在應用前須在沸水浴中加熱10min，而對酵母tRNA可不用加熱變性。
（1）應用預雜交液稀釋地高辛標記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據于待測核苷酸含量和實踐的結果。如對于檢測大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。
（2）預雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周圍水份，加30μl雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37℃過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫），0.5×SSc 37℃漂洗半小時，0.5×SSC室溫漂洗半小時。
4．地高辛顯示（同前）。
（二）同位素標記寡核苷酸探針的應用
1．組織處理大鼠應用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經心臟灌注4%多聚甲醛-磷酸緩沖液中，約2h后（也可置于4℃冰箱過夜）取腦浸于同樣固定液中加10%蔗糖溶液過夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃），厚14μm左右，貼于有粘附劑的載片上，37℃或室溫干燥以增加切片的粘附性。
2．雜交前處理同本章 第二節 放射性標記cRNA探針一節 。
3．雜交37℃過夜，余細胞同前。
4．雜交后漂洗2×SSc 5min×3，1×SSc 1min室溫，0.5×SSc 55℃15min×2，室溫漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脫水，切片室溫干燥。
5．浸核乳膠切片浸入核乳膠，黑盒封閉，在4℃曝光2～3周（視同位素種類），顯影，復染，觀察。
第四節 原位雜交組織化學與免疫細胞化學結合法
原位雜交組化（ISHH）與免疫組織化學（IHC）結合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或兩個相鄰切片進行染色，這樣就可以同一細胞中顯示出某種mRNA和相應的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉錄和蛋白、多肽合成的動力學。ISHH與IHC結合法可以在相鄰切片上分別進行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上進行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結果，易成功，但易產生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進行結合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色過程中污染有少量RNase的液體所降解，因而在實踐中往往首先進行原位雜交組化染色，這種次序使結合法易成功。但在操作方法中應注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交后沖洗中適當減低漂洗溫度。
一、同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯合程序
（1）切片入PBS沖洗5min，最好是將切片漂洗于滅菌器皿中。
（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。
（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。
（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。
（6）PBS沖洗2×3min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。
（8）2×SSC沖洗10min。
（9）雜交：如是cDNA探針用前需進行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾干，加含探針的雜交液10μl于切片上，蓋上22×22mm的硅化蓋片或相當大小看蠟膜，3H標記探針每10μl雜交液含1×105cpm探針，32P或35S標記探針每10μl雜交液含5×105cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份盡量吸干，然后入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液后43℃保溫12～16h。
（10）4×SSc 37℃沖洗10～30min。