原位雜交組織化學雜交前處理

雜交前處理的目的在于提高組織通透性。增加靶核酸的可及性以及防止RNA或DNA探針與組織細胞或載玻片之間的非特異性結合，從而增強雜交信號，降低背景。雜交前處理的具體方法和步驟因所采用的固定劑、組織標本以及探針不同而異。用溫和的非交聯固定劑固定的細胞培養標本和冰凍切片，不需經特殊的雜交前處理，一般均能獲得較好的雜交反應結果。而用交聯固定劑固定的標本。尤其是福爾馬林固定的石蠟切片．則需經雜交前處理才能獲得較好的結果。雜交前處理主要包括增強組織的通透性和核酸探針的穿透通性，減低背景染色兩個方面。

    （一）增強組織通透性和核酸探針穿透性

    對于用戊二醛等強交聯固定劑固定的組織，由于固定劑與蛋白質產生廣泛交聯，需要應用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用去污劑或某些消化酶處理．通過這種處理可廣泛除去蛋白質而增強組織的通透性和探針的穿透性，提高雜交信號．但同時也會降低RNA的保存量?影響組織結構的形態，導致標本從載玻片上脫落，因此在用量和時間上應加以注意。

    1．去污劑處理  常用去污劑為TritonX-100，一般將切片浸入含0．2％～0．5％Triton X—100的PBS內處理15分鐘。

    2．蛋白酶處理  蛋白酶K的消化作用在原位雜交中十分重要。其濃度及孵育時間視組織種類、固定劑種類、切片厚度而定，一般應用蛋白酶K 1ug／m1（于0．1rnol／L Tris，50mmol/L EDTA，pH8．0緩沖液中），37~C孵育15～30分鐘，以達到蛋白充分消化作用而不影響組織形態為目的。蛋白酶K還具有消化靶DNA周圍蛋白質從而提高雜交信號的作用。在蛋白酶K消化后，用蛋白酶K抑制劑終止反應，即在冷PBS中清洗及在含0．2％或0．1mol／L甘氨酸的PBS中清洗。為保持組織結構，通常用4％多聚甲醛再固定3～5分鐘。石蠟切片在此之前必須先脫蠟．并經下行酒精入水。

    （二）減低背景染色

    1．酸酐和稀酸處理  為了防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合?降低背景，雜交前標本可用0．2；％醋酸酐處理10分鐘。經醋酸酐處理后，組織中蛋白的堿性基團通過乙酰化而阻斷，使蛋白質的等電點偏向酸性，從而抑制非特異性吸附。組織和細胞標本也可在雜交前用稀酸（如0．2mol／L HCl 10分鐘）處理。稀酸處理能使堿性蛋白變性，如再結合蛋白酶消化。即可將堿性蛋白移除．這樣不僅能增強靶核酸探針的可及性，也可避免堿性蛋白與核酸之間的非特異性結合．達到降低背景的目的。

    2．預雜交  預雜交是指在雜交前用不含探針的預雜交液在雜交溫度下預先孵育標本1—2小時，以阻斷標本中可能與探針產生非特異性結合的位點，達到減低背景染色的目的。預雜交是減低背景染色的一種有效手段。

    3．內源性生物素和酶的抑制  非放射性原位雜交，如用生物素、HRP或AKP做標記物，組織中內源性的生物素、過氧化物酶或AKP則應事先阻斷。當對含有內源性生物素較 豐富的組織（如肝和腎組織）用免疫細胞化學ABC法檢測雜交反應時，標本可先用未標記的卵白素—生物素孵育?以阻斷內源性生物素。適宜的雜交前蛋白酶消化有利于消除內源性生物素的干擾。用5％脫脂奶粉緩沖鹽液來稀釋標記的親和素以及將標本浸于含2％牛血清白蛋白的緩沖液，均可防止或抑制標記的親和素與組織標本之間的非特異性結合。對于內源性的AKP和過氧化物酶可通過將標本分別浸于20％醋酸（4C）中15秒或0．019g／L過碘酸淋洗和用含1％H₂O₂的蒸餾水或甲醇溶液室溫孵育30分鐘加以阻斷。