原位PCR技術

除了經典的原位雜交外。原位雜交可與其他組織化學技術相結合，或與其他分子生物學技術相結合，使其應用范圍擴大，成為更有應用價值的技術。

PCR技術是根據生物體內DNA復制的特點而建立的在體外經酶促反應將特定DNA序列進行高效和快速擴增的技術，它可將單一拷貝或低拷貝的待測核酸以指數形式擴增而達到用常規方法可以檢測的水平，但不能進行組織學定位。原位PCR（in situ PCR）技術由Hasse等人于1990年建立，是將PCR的高效擴增與原位雜交的組織學定位相結合，在不破壞組織細胞形態結構的前提下，利用原位完整的細胞作為一個微反應體系來擴增細胞內的靶序列，在組織切片、細胞涂片或培養細胞中來檢測和定位微量核酸。

原位PCR技術的基本原理與液相PCR的擴增原理相似，即在耐熱的DNA聚合酶作用下，以合成的DNA作為引物。經過加熱（變性）、冷卻（退火）、保溫（延伸）等改變溫度的熱循環．使特異性靶序列DNA產量以2”倍的方式擴增。原位PCR是先將細胞或組織進行固定和酶消化處理，以保持組織細胞的良好形態結構。使細胞膜和核膜均具有一定通透性，再滴加PCR反應所需的各種試劑于樣本上。然后將載有細胞或組織的玻片放入原位PCR儀上進行擴增反應。其結果可在顯微鏡下直接觀察或用標記探針進行原位雜交后再用顯微鏡觀察。根據在擴增反應中所用的dNTP或引物是否標記。原位PCR可分為直接法和間接法兩類以及原位逆轉錄PCR。

    1．直接法原位PCR  在反應體系中使用標記的三磷酸核苷酸或引物，在標本進行PCR擴增時，標記物摻入到擴增產物中。通過顯示標記物，可原位顯示靶DNA或RNA，擴增產物可直接觀察而無需進行原位雜交。目前常用的標記物有地高辛、FITC和生物素等。該方法的優點是使擴增產物直接攜帶標記分子，因此操作簡便省時，但特異性較差，擴增效率較低，易出現假陽性．特別是在組織切片上，假陽性信號主要來自標本中受損DNA的修復過程。由于固定、包埋及制片過程均可造成DNA損傷?受損的DNA可利用反應體系中的標記dNTP進行修復。這樣，標記物則摻人到非靶序列DNA分子中，產生假陽性。另外，引物與模板的錯配也可導致假陽性信號的產生。在直接原位PCR的基礎上建立的5^，端標記引物原位PCR方法，雖然也有上述非特異性修復和擴增現象，但由于無標記物的摻人，故非特異性產物雖可以產生卻無法顯示，從而避免了假陽性結果。

    2．間接法原位PCR  是先將引物、核苷酸及酶等反應物引入細胞內進行擴增，然后用特異性標記探針與擴增產物進行原位雜交?檢測細胞內擴增的DNA產物。該方法能克服由于DNA修復或引物錯配引起的非特異性染色問題，使擴增效率提高，特異性增強，故是目前應用zui為廣泛的原位PCR方法。該法需在擴增反應后再進行原位雜交，故操作步驟繁瑣，用時長。

    3．原位逆轉錄PCR  是將逆轉錄反應和PCR相結合，在原位檢測細胞內低拷貝mRiNA的方法。整個反應分兩步進行．*步以mRNA為模板，在逆轉錄酶催化下合成cDNA；第二步則以cDNA為模板，用PCR對靶序列進行擴增，zui后用標記的探針與擴增的cDNA進行原位雜交而間接檢測細胞內的mRNA。該方法的優點是不需從標本中提取mRNA，不會因在核酸的分離中造成靶序列破壞而致信號丟失。與液相PCR不同的是，原位RT-PCR反應過程在固定的組織或細胞標本上進行，標本需先用DNA酶處理以破壞組織細胞中的DNA，以保證PCR擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的

DNA。其余基本步驟與液相的RT-PCR相似。

    就具體方法而言，原位逆轉錄PCR與上述原位PCR一樣，也可分為直接法和間接法，操作時的注意事項也相似，不同的是在進行原位逆轉錄PCR時要特別防止RNA酶對待測核酸的降解。另外，由于在原位PCR前要進行逆轉錄過程。因此實驗周期較長，操作過于復雜。但隨著將逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶功能合二為一的新型reverse transcription thermal（rTth）酶的商品化，原位逆轉錄PCR整個操作過程與普通原位PCR十分相似。其方法是將待測核酸與rTth酶、特異性引物和含有標記的dUTP和dNTP同時滴加于切片上。在原位PCR儀上先用600c溫浴30分鐘，以從待測mRNA逆轉錄cDNA，再經20個PCR循環。擴增特異性cDNA，并同時使擴增的cDNA片段中摻人標記物，zui后用組織化學或免疫組織化學方法檢測陽性信號。