實驗概要
原位PCR技術自上世紀90年代初建立至今，科學家就一直對原位PCR的技術和應用進行研究，目前該項技術已日臻完善。原位PCR既能分辨帶有靶序列的細胞又能標出靶序列在細胞內的位置，在分子和細胞水平上研究疾病的發病機理、臨床過程以及病理的轉歸，其特異性和敏感性均高于一般PCR技術。在病毒學、病理學和腫瘤已經成功展示了許多令人矚目的成就，具有重要的實用價值。
實驗原理
原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是一種把原位雜交的細胞定位技術與PCR的高靈敏度相結合的技術，即通過PCR技術以DNA為起始物，對靶序列在染色體上或組織細胞內進行原位擴增，使其拷貝數增加，然后通過原位雜交方法檢測，從而對靶核酸進行定性定量定位分析。隨著PCR技術的發展，出現了以mRNA為起始物，通過反轉錄合成靶序列的cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增，以檢測細胞內mRNA靶序列的原位反轉錄PCR。原位PCR的大致流程主要包括：(1)染色體、細胞及組織切片樣品的制備。此階段中固定很重要，因為并非所有的固定劑都有利于PCR及原位PCR 反應。(2)PCR前處理，包括石蠟切片、去石蠟、染色體變性和細胞穿透，此步既可有利于PCR反應試劑到達靶目標，又可防止擴增后產物漏出，蛋白酶和胰酶是常用的消化膜試劑，不同材料處理的時間和所用酶的濃度有所不同。(3)PCR擴增，一般采用熱啟動PCR，病毒RNA的擴增需用逆轉錄PCR。(4)原位雜交及檢測。原位PCR按檢測方法不同分為：直接原位PCR；間接原位PCR；原位反轉錄PCR；原位再生式序列復制反應。
實驗步驟
對DNA靶序列的PCR擴增主要由高溫變性(94℃×1min)、低溫退火(55℃
×3min)、適溫延伸(72℃×2min)三步組成一輪的熱循環重復而成。理論上每次循環PCR產物以2n指數遞增，經20～25次循環后，PCR產物的積累可達到最大值，可使靶序列擴增106～7倍。但在實際操作中，每步反應率不可能是100%，因此一般循環次數設定為25～30次。過多的循環次數(>30次)之后酶的催化反應趨于飽和，就會出現“平臺效應”。
1. 載玻片用DEPC水洗1min使蛋白酶失活，再用無水乙醇洗1min，室溫干燥。此簡單步驟即可去除/滅活蛋白酶，不需加熱滅活。
2. 取2張切片分別加入：1ul 10×緩沖液(此液由35ul 3mol/L NaAc，1mol/L MgCl2和60ul DEPC水配制而成)，1ul無RNA酶的DNA酶，8ulDEPC水。
3. 用一個滅菌的聚丙烯塑料封條蓋住溶液以防止干燥，將載玻片置于一個37℃的濕容器內。
4. 過夜消化，除去封條，用DEPC水洗1min，再用無水乙醇洗，室溫干燥。
5. 取一張經DNA酶消化的切片，加入下列溶液：2ul MgCl2(25mmol/L貯存)，
1ul RT緩沖液，1ul dATP、dCTP、dTTP(每種以10mmol/L貯存)，1.5ul DEPC水，0.5ul
3′端引物(20umol/L貯存)，0.5ul RNA酶抑制劑，0.5ul反轉錄酶。這些試劑在RT-PCR試劑盒中均有。
6. 為了防止干燥，用一小滴指甲油固定住封條，將載玻片放入PCR儀的加熱鋁板上，蓋滅菌礦物油，42℃反應30min。
7. 除去封條，用二甲苯洗5min除去指甲油，再用無水乙醇洗5min，室溫干燥。
8. 每一張載玻片加2.5ul PCR緩沖液，4.5ul MgCl2(25mmol/L貯存)，4.0ul
dNTP(每種核苷酸終濃度200umol/L)，1.0ul 2% BSA，0.4ul地高辛標記的dUTP(1mmol/L貯存液),
1.0ul引物1(20umol/L), 1.0ul引物2(20umol/L), 11ul水, 0.5U Taq DNA聚合酶。.
9. 加入上述25ul溶液到載玻片上，蓋上封條，用指甲油固定。
10. PCR儀加熱至80℃，加入預熱的礦物油，終止程序，升溫至94℃，運行PCR程序： 94℃ 1min、55℃ 3min、72℃ 2min25個循環。
11. 去除封條和礦物油，用二甲苯洗5min，乙醇5min，室溫干燥。