原核細胞體外翻譯系統

適用于杯狀 DNA 的 S30 提取物 適用于線狀 DNA 的 S30 提取物   適用于環狀 DNA 的 T7S30 提取物

無核酸酶的水 [35S] 標記的甲硫氨酸 1 mmol L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物 缺少氨基酸的 S30 反應混合液

—70℃ 冰箱 微量移液器 離心機 冰浴

―、材料與設備

1) 無核酸酶的水。

2)[35S] 標記的甲硫氨酸（1.25×10-5mol/L12000Ci/mmol)

3）1 mmol/L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物

4) 缺少氨基酸的 S30 反應混合液（Promega 公司）

5) 適用于杯狀 DNA 的 S30 提取物（Promega 公司）

6) 適用于線狀 DNA 的 S30 提取物 (Promega 公司）

7) 適用于環狀 DNA 的 T7S30 提取物 (Promega 公司）

8)—70℃ 冰箱

9) 微量移液器

10) 離心機

11) 冰浴

二、操作方法

(一）適用于對環狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統
           
      
2）輕輕渦旋，然后離心 5s, 以使反應混合物沉入管底。

3)37℃ 孵育 1?2 h。

4) 將反應管置于冰浴上 5 min, 以終止反應。

5) 分析試驗結果。利用三氯乙酸（TCA) 免疫沉淀實驗和 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以分析產物，

(二）適用于對線狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統

具體操作步驟同「(一）適用于對環狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統」中的 1)?5)。反應體系如表 4.2 所示



(三) 適用于對環狀 DNA 迸行體外翻譯的大腸桿菌 T7S30 提取物系統

具體操作步驟同「一）適用于對環狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統」中的 1)?5)，反應體系如表 4.3 所示；

1)DNA 用量的優化。逋常，一個反應體系屮不應包含超過 4ug 的 DNA。因為隨 DNA 的不斷增加將會導致較多的未摻入標記氨基酸的目的蛋白的產生、從序列內部起始翻譯反應的增加以及過￥結朵翻譯的產物的不斷增加。

2) 因為 S 標記的氨基酸極易被鉍化成亞砜類而失去活性，故應將 [35S] 標記的甲硫氨酸分裝后保存于一 70℃, 每次融化后使用，以取得最好的反應結果。

3) 模板 DNA 和水的純度是非常重要的。如果翻譯效率低下，則應檢查水與模板的純度。

4) 反應可在 24?37℃ 的溫度范闈內進行，37°C 時反應速度最快，需時約 2 h。較低的溫度會導致較低的催化速率，且反應時間會相應延長數小時。假如在 37°C 反應 lh 沒冇產牛預期的結果，則應嘗試在低溫反應較長的時間，這樣有利于增加蛋白的表達量和蛋白表達的特異性。