實驗材料 適用于杯狀 DNA 的 S30 提取物 適用于線狀 DNA 的 S30 提取物 適用于環狀 DNA 的 T7S30 提取物
試劑、試劑盒 無核酸酶的水 [35S] 標記的甲硫氨酸 1 mmol L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物 缺少氨基酸的 S30 反應混合液
儀器、耗材 —70℃ 冰箱 微量移液器 離心機 冰浴
實驗步驟
―、材料與設備
1) 無核酸酶的水。
2)[35S] 標記的甲硫氨酸（1.25×10-5mol/L12000Ci/mmol)
3）1 mmol/L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物
4) 缺少氨基酸的 S30 反應混合液（Promega 公司）
5) 適用于杯狀 DNA 的 S30 提取物（Promega 公司）
6) 適用于線狀 DNA 的 S30 提取物 (Promega 公司）
7) 適用于環狀 DNA 的 T7S30 提取物 (Promega 公司）
8)—70℃ 冰箱
9) 微量移液器
10) 離心機
11) 冰浴
二、操作方法
(一）適用于對環狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統
2）輕輕渦旋，然后離心 5s, 以使反應混合物沉入管底。
3)37℃ 孵育 1?2 h。
4) 將反應管置于冰浴上 5 min, 以終止反應。
5) 分析試驗結果。利用三氯乙酸（TCA) 免疫沉淀實驗和 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以分析產物，
(二）適用于對線狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統
具體操作步驟同「(一）適用于對環狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統」中的 1)?5)。反應體系如表 4.2 所示
(三) 適用于對環狀 DNA 迸行體外翻譯的大腸桿菌 T7S30 提取物系統
具體操作步驟同「一）適用于對環狀 DNA 進行體外翻譯的大腸桿菌 S30 提取物系統」中的 1)?5)，反應體系如表 4.3 所示；
注意事項
1)DNA 用量的優化。逋常，一個反應體系屮不應包含超過 4ug 的 DNA。因為隨 DNA 的不斷增加將會導致較多的未摻入標記氨基酸的目的蛋白的產生、從序列內部起始翻譯反應的增加以及過￥結朵翻譯的產物的不斷增加。
2) 因為 S 標記的氨基酸極易被鉍化成亞砜類而失去活性，故應將 [35S] 標記的甲硫氨酸分裝后保存于一 70℃, 每次融化后使用，以取得最好的反應結果。
3) 模板 DNA 和水的純度是非常重要的。如果翻譯效率低下，則應檢查水與模板的純度。
4) 反應可在 24?37℃ 的溫度范闈內進行，37°C 時反應速度最快，需時約 2 h。較低的溫度會導致較低的催化速率，且反應時間會相應延長數小時。假如在 37°C 反應 lh 沒冇產牛預期的結果，則應嘗試在低溫反應較長的時間，這樣有利于增加蛋白的表達量和蛋白表達的特異性。
