原生質體分離時主要應考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。
（1）外植體來源：生長旺盛、生命力強的組織和細胞是獲得高活力原生質體的關鍵，并影響著原生質體的復壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用于原生質體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養物（Suspension cultures）、原球莖、花瓣和葉表皮等。葉肉細胞是常用的材料，葉片很易獲得而且能充分供應。取材時，一般用剛展開的幼嫩葉片。另一個分離原生質體的常用材料是愈傷組織或懸浮細胞，采用其作材料可以避免植株生長環境的不良影響，可以常年供應，易于控制新生細胞的年齡，處理時操作方便，無需消毒。選用懸浮細胞作材料時，需每隔3-5天繼代一次，培養一段時間使細胞處于旺盛生長狀態。一般在繼代后的第三天游離原生質體。
（2）酶液組成和濃度
植物細胞壁由三個主要成分構成：纖維素，壁干重的25-50%，半纖維素，平均53%，果膠質，5%用來分離植物原生質體的酶制劑主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶等，酶解花粉母細胞和四分體小孢子時還要加入蝸牛酶。纖維素酶的作用是降解構成細胞壁的纖維素，果膠酶的作用是降解連結細胞的中膠層，使細胞從組織中分開，以及細胞與細胞分開。