去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中的應用（二）

4.ALKBH5抑 制胰腺ai細胞生長和轉移
將過表達ALKBH5的ai細胞移植到裸鼠體內，發現過表達ALKBH5的ai細胞生成的腫 瘤體積明顯小于對照組，并且細胞生長的指示分子Ki-67的表達也明顯降低。染色顯示過表達ALKBH5的組織中侵襲和轉移的指示分子MMP-2和MMP-9表達降低，敲降ALKBH5的組織中兩分子則升高。原位和異種移植模型中都得到了相似的結果。

5.ALKBH5作用于PER1調控胰腺ai細胞
作者通過ELISA發現過表達ALKBH5的細胞中m6A整體水平下降。于是通過m6A-seq（云序提供服務）進一步尋找去甲基化酶可能作用的靶基因。比較過表達ALKBH5的細胞，對照細胞中發現了7226個特有的甲基化位點，其中應含有ALKBH5作用的基因。通過對RNA-seq和m6A-seq（云序提供服務）兩組學聯合分析，篩選出78個表達和甲基化水平都明顯差異的基因，再與7226個對照組特有甲基化位點所在的基因取交集， 篩選出9個基因。再結合可視化，鎖定了3’UTR區有明顯m6A峰的基因PER1。
 

6.缺少ALKBH5引發m6A識別蛋白YTHDF2誘導的mRNA降解，導致PER1的mRNA水平降低
qPCR顯示ALKBH5過表達細胞中PER1表達升高，ALKBH5敲降細胞中PER1表達降低, 表明ALKBH5可調控PER1表達。MeRIP-qPCR（云序提供服務）則驗證了過表達ALKBH5降低PER1的m6A水平。雙熒光素酶實驗（云序提供服務）進一步驗證了ALKBH5作用在mRNA上的motif序列并能調控PER1的表達水平。另外由于PER1 mRNA上m6A位點與識別蛋白YTHDF2的結合位點臨近，作者進行了敲降實驗，發現敲降YTHDF2也能導致PER1 mRNA水平升高。這些結果表明，ALKBH5的敲降，導致PER1 mRNA的m6A水平升高，進而被YTHDF2識別增強了mRNA降解。
 

7.PER1抑 制胰腺ai細胞
為了驗證PER1對胰腺ai的影響，作者首先通過qPCR驗證了42個患者的腫 瘤組織中PER1表達降低。生存分析顯示PER1低表達和總生存率的降低有相關性，并且對TCGA數據庫數據的分析表明PER1表達與ALKBH5水平正相關。CCK-8, EdU 和 transwell實驗驗證了PER1異位表達可抑 制胰腺ai進展，并部分緩解ALKBH5敲降帶來的細胞增值和侵襲。另外，作者還發現了回補PER1表達導致 ATM依賴信號通路的重激 活，包括p-ATM, p-CHK2, p-CDC25C, p-P53, P21,和p-CDK表達的上升。CoIP（云序提供服務）實驗也驗證了ATM和PER1的相互作用。
 

8.PER1誘導恢復P53表達增強ALKBH5轉錄
作者發現PER1過表達引起P53升高后，ALKBH5水平也隨之升高，同時免疫染色也顯示整體m6A水平降低。于是為了驗證P53和ALKBH5的關系，通過ChIP實驗和雙熒光素酶實驗（云序提供服務），驗證了P53與ALKBH5的啟動子區結合，激 活ALKBH5的轉錄。